食物中晚期糖基化终产物对5/6肾切除大鼠的肾脏损害作用及其机制

摘要

研究背景 晚期糖基化终产物(advancedglycationendproducts，AGEs)是糖的醛基组和蛋白质的氨基酸组之间非酶性糖基化反应(Maillard反应)的终产物。是多种不同分子结构物质的混合物。目前已明确结构的一些AGEs组分是：戊糖苷、羧甲基赖氨酸(CML)、咪唑鎓盐类(GOLD，MOLD)、咪唑啉酮和吡咯啉等。 正常人体内该反应进行的非常缓慢，通常只发生于某些转换率很低的蛋白质，故各种胶原结构中的AGEs水平随年龄增长而缓慢增加。但在慢性肾功能衰竭时，血浆AGEs的水平比糖尿病患者及肾功能正常者升高约7倍，组织中AGEs的潴留与血浆AGEs的水平升高相一致。造成慢性肾功能衰竭时AGEs蓄积的原因尚不清楚，目前认为除经典的糖基化通路合成增加或者经肾脏排泄AGEs下降外，氧化和羰基应激也具有重要作用。 近年研究发现人类日常饮食中含有大量AGEs，因为食物在加热过程中会产生大量AGEs。研究表明食物中的AGEs约有10％～30％经消化道吸收进入体内，其中主要是低分子量的AGEs，其吸收的量远远超过在高血糖状态下内源性生成的AGEs的量。经消化道吸收的AGEs量与循环AGEs水平直接相关。 目前认为AGEs是一类重要的尿毒症毒素，已经证实AGEs参与透析相关性淀粉样变、加速性动脉粥样硬化等尿毒症并发症的发病机制。我们假设食物中AGEs通过加速体内AGEs蓄积，促进肾脏纤维化加速慢性肾脏病的进展。本课题以5/6肾切除大鼠作为慢性肾脏疾病的动物模型，通过喂饲不同AGEs含量饲料，观察食物中的AGEs对慢性肾脏疾病肾脏纤维化的影响，并且对其作用机制进行进一步的探讨。 材料和方法 一：含不同水平AGEs大鼠饲料的制作及饲料中AGEs含量的测定 普通大鼠饲料由广东省实验动物中心提供。高AGEs大鼠饲料：新鲜烤制的面包，取面包皮在烤箱180℃烘烤2小时，90℃放置22小时后，与普通大鼠饲料按1∶1混合压制成颗粒饲料；低AGEs大鼠饲料：新鲜烤制的面包，取面包芯室温自然风干，按1∶1比例与普通大鼠饲料混合后压制成颗粒饲料。使用荧光分光光度法和竞争性ELISA法测定三种大鼠饲料中AGEs荧光强度和CML的含量。高AGEs饲料比普通饲料AGEs荧光强度增加约1.25倍，CML含量增加约2.62倍；比低AGEs饲料AGEs荧光强度增加约1.76倍，CML含量增加约4.95倍。 二.实验动物分组及标本收集 雄性Sprague-Dawley大鼠120只(南方医院实验动物中心提供)，体重220～240g，行5/6肾切除术(分两步经背部切口切除全部右肾和左肾的2/3)或行假手术(经背部切口暴露肾脏，牵拉肾脏撕裂肾包膜后放回原位)，手术后一周5/6肾切除大鼠根据切除左肾比例(切除左肾肾组织重量/右肾重量×100％)随机分为三组：(1)高AGEs饲料组(2)低AGEs饲料组；(3)普通饲料组。假手术大鼠。处死前一天禁食，自由饮水，放代谢笼收集24小时尿液。以0.3％戊巴比妥钠注射液(3.5mg/100g体重)腹腔注射麻醉，腹主动脉取血。50ml冰生理盐水灌注后摘取左肾。 三.血清及肾组织匀浆中CML含量的测定 采用竞争ELISA法测定血清及肾组织匀浆中CML含量。 四.肾功能测定 使用试剂盒测定血清肌酐和尿肌酐水平，根据文献方法计算内生肌酐清除率(Ccr)，并用体重校正；考马斯亮兰法测定24小时尿蛋白定量。 五.肾组织病理学观察 肾组织经4％中性福尔马林缓冲液固定后，石蜡包埋，2μm切片，经PAS、Masson染色，双盲法观察组织病理学改变。采用Reijis半定量法评价肾小球硬化程度和肾小管间质纤维化程度。 六.免疫组织化学染色 肾组织4μm石蜡切片依据文献方法行免疫组化染色。使用下列第一抗体：抗ED-1单克隆抗体；多克隆兔抗鼠TGF-β1抗体；多克隆兔抗鼠MCP-1抗体；多克隆兔抗鼠Ⅰ型和Ⅳ型胶原抗体。 七.氧化应激指标和炎症因子的检测 用分光光度法测定血清和肾组织匀浆中晚期氧化蛋白终产物(AOPPs)含量。硫代巴比妥酸反应法(TBARS)测定24小时尿和肾组织匀浆中TBARS物质含量。依据Flohe等的方法测定血清及肾组织匀浆中硒谷胱甘肽过氧化物酶(SeGSHPx)活性。血清及尿中MCP-1和TGF-β1含量分别采用相应的商品化的ELISA试剂盒检测。 八.RT-PCR检测肾组织MCP-1、TGF-β1mRNA表达 九.统计分析 手术各组之间以及手术对照组和假手术组之间采用析因分析以及LSD法比较，同一观察时间点手术各组之间采用单因素方差分析LSD法比较，同一观察时间点手术对照组和假手术组之间采用独立样本的t检验。血清和肾组织匀浆CML含量与24小时尿蛋白定量、肌酐清除率、肾组织病理改变和免疫组织化学半定量积分、氧化应激和炎症因子指标的相关关系采用双变量相关分析。 结果 一.5/6肾切除大鼠肾功能及体内AGEs水平的变化 喂饲普通饲料的5/6肾切除大鼠24小时尿蛋白含量，血清肌酐水平随时间延长进行性升高，在各个时间点均显著高于假手术组，同时肌酐清除率显著下降。 喂饲普通饲料的5/6肾切除大鼠血清和肾组织匀浆CML含量随时间进行性升高。 二.饮食摄入AGEs对循环和肾组织中AGEs水平的影响 喂饲含高AGEs饲料显著增加5/6肾切除大鼠循环中AGEs的含量，在第13周喂饲高AGEs饲料大鼠与普通饲料组相比，血清CML的含量增加约0.6倍，相反，在第13周喂饲含低AGEs饲料大鼠血清CML含量比普通饲料组降低。 三.饮食摄入AGEs对5/6肾切除大鼠肾功能的影响 喂饲含高AGEs的饲料显著增加5/6肾切除大鼠尿蛋白排泄量，且随时间进行性加重(处理方式和观察时间之间交互效应显著F=17.125，p＜0.001)，与喂饲普通饲料的5/6肾切除大鼠相比，高AGEs饲料组大鼠尿蛋白含量在三个时间点均显著升高(p＜0.05)。 四.饮食摄入AGEs对慢性肾功能不全大鼠残肾代偿性增生的影响。 喂饲含高AGEs饲料显著增加5/6肾切除大鼠左肾与体重的比例，高AGEs饲料组大鼠左肾与体重的比例在三个时间点均显著高于普通饲料组(p值均＜0.05)，而低AGEs饲料组大鼠左肾与体重的比例显著低于普通饲料组，第13周差异有显著性(p＜0.05)。 五.饮食摄入AGEs对慢性肾功能不全大鼠肾脏纤维化的影响 喂饲含高AGEs饲料显著增高5/6肾切除大鼠肾小球硬化程度，在第13周高AGEs饲料组大鼠肾小球硬化指数显著高于普通饲料组(p=0.013)，相反，与普通饲料相比，低AGEs饲料组大鼠肾小球硬化指数明显降低(p=0.03)。 免疫组化染色显示，5/6肾切除大鼠残肾肾组织MCP-1表达随时间延长显著增强(手术方式和观察时间之间交互效应显著F=4.757，p=0.013)，喂饲含高AGEs饲料显著上调5/6肾切除大鼠残肾肾组织MCP-1表达(处理方式和观察时间之间交互效应显著F=4.785，p=0.002)。 RT-PCR结果显示：喂饲含高AGEs饲料显著上调第13周5/6肾切除大鼠MCP-1mRNA的表达(F=11.198，p=0.001)，高AGEs饲料组大鼠肾组织MCP-1mRNAPCR产物吸光度比值显著高于普通饲料组(p=0.03)，而低AGEs饲料组大鼠肾组织MCP-1mRNAPCR产物吸光度比值显著低于普通饲料组(p=0.04)。 免疫组化染色显示，5/6肾切除大鼠残肾肾组织TGF-β1表达随时间延长显著增强(手术方式和观察时间之间交互效应显著F=4.757，p=0.013)，喂饲含高AGEs饲料显著促进5/6肾切除大鼠残肾肾组织TGF-β1表达(处理方式和观察时间之间交互效应显著F=3.906，p=0.006)，在第13周高AGEs饲料组大鼠肾小球及肾间质TGF-β1表达半定量积分值显著高于普通饲料组(p值均＜0.05)；相反，喂饲含低AGEs饲料减轻5/6肾切除大鼠残肾肾组织TGF-β1的表达，其半定量积分在第13周均显著低于普通饲料组(p值均＜0.05)。 RT-PCR结果显示：高AGEs饲料显著上调第13周5/6肾切除大鼠肾组织TGF-β1mRNA的表达(F=9.237，p=0.002)，高AGEs饲料组大鼠TGF-β1mRNAPCR产物吸光度比值显著高于普通饲料组(p=0.04)，而低AGEs饲料组大鼠 结论 食物中的AGEs促进5/6肾切除大鼠循环和肾组织AGEs潴留，增加尿蛋白排泄量，降低内生肌酐清除率，促进肾小球肥大，残肾组织肾小球硬化和肾间质纤维化。其机制可能与促进残肾组织炎症反应和氧化应激有关。因此，限制饮食中AGEs的含量应作为延缓慢性肾脏病进展的措施之一。

目录

文摘

英文文摘

前言

1材料与方法

2结果

3讨论

4小结

5参考文献

中英文缩略语词对照表

晚期糖基化终产物在慢性肾功能衰竭中的作用

致谢

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