肾康丸处方优化研究及其对糖尿病肾病大鼠肾皮质转化生长因子β2型受体表达的影响

摘要

糖尿病肾病(DN)是糖尿病(DM)全身微血管病变的肾脏表现，为DM常见的慢性并发症之一。目前，DM已成为继肿瘤、心脑血管病之后第3位严重危害人类健康的慢性病，全球约有1.35亿名DM患者，我国估算为3000～4000万人，且发病率有不断增高趋势。DN一旦出现大量蛋白尿，提示预后不良，常进展至终末期肾衰，给个人和社会造成巨大负担，因此出现微量白蛋白尿(MAU)的早期DN进行积极治疗显尤为重要，可以明显减少临床期DN的发病率或者延缓临床期DN的发生。本实验分两部分研究了治疗DN的经验方剂肾康丸，第一部分应用正交试验方法探讨肾康丸的组方可能的最佳剂量配比，及方中对微量白蛋白排泄率(UAE)起显著治疗作用的方药，并与原方进行比较，观察2方对DN大鼠的肾保护效果；第二部分应用免疫组化(SABC法)及逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测肾康丸治疗后DN大鼠肾皮质转化生长因子β2型受体(TβRⅡ)抗原及其mRNA表达的情况，观察肾康丸对DN大鼠肾皮质TβRⅡ表达的影响。 第一章肾康丸处方正交设计法优化研究 目的：探讨治疗DN经验方肾康丸改善UAE有效药味及最佳剂量配比。 方法：选用L27(313)正交表，以肾康丸中黄芪(A)、B、水蛭(C)、D、E、玉米须(F)6味中药为6个因素，考察A与B、A与C、A与F的交互效应，按经验选取每味中药的3个剂量水平，对剂量水平随机排序，按正交表组成27个处方，每个处方以水提法制成3g/m1悬浊液，按1.08ml/220gwt分别灌胃，75只SD大鼠采用单侧肾切除后腹腔注射链脲佐菌素制作DN大鼠模型，DN成模时有59只大鼠，随机分成27组，每组随机选取1只大鼠作考察对象，每组中的另外1-2只大鼠作备用大鼠接受考察大鼠相同处理，当考察大鼠在实验结束前死亡时在备用大鼠中随机选取1只大鼠继续观察，并取用备用鼠治疗前的UAE值。以治疗前UAE为协变量，以治疗8周后UAE作为考察指标进行正交设计的协方差分析及基于协方差分析的多重比较，得出肾康丸中对治疗后UAE有显著治疗效果的中药及可能的最佳配比。 结果： 1、肾康丸6味药中A、C、F对DN大鼠治疗末UAE有显著治疗效果(P＜0.040)，而B、D、E对UAE的影响不显著(P＞0.056)，A与B、A与C、A与F之间交互效应不显著(P＞0.175)。 2、肾康丸方中对DN大鼠UAE影响大小顺序：A＞F＞C，优化方中A、B、C、F均取中剂量水平，D、E均取最小剂量水平为佳。 3、肾康丸原方与优化方的肾保护作用无显著差异。 4、肾康丸给药前后UAE的变化：给药前造模各组之间UAE水平比较无显著性差异(P=0.607)，与正常组比较均显著升高(P＜0.05)。给药前后比较DNS组、DNY组、DNK组UAE值显著下降(t值分别为-5.188、-3.522、-3.766；P＜0.013)，但均较NC组高(P＜0.05)；DN组实验结束时UAE值显著升高(t=3.072，P=0.028)，与DNS、DNY、DNK组治疗后比较均有显著性意义(P＜0.05)。治疗后DNS、DNY、DNK三组间UAE值比较无显著差异(P＞0.337)。 5、各组大鼠体重、肾重、相对肾重、血生化情况：治疗后DNS、DNY组体重(bwt)、肾重/体重(k/bwt)、尿素(Urea)、总胆固醇(TC)及三酰甘油(TG)均较DN组有显著改善作用(P＜0.05)，但仍较NC组差(P＜0.05)。DNS与DNY组比较，体重(bwt)、肾重(kwt)、肾重/体重(k/bwt)、血肌酐(Scr)、尿素(Urea)、总胆固醇(TC)及三酰甘油(TG)比较均无显著差异(P＞0.069)，与DNK比较，DNS、DNY的相对肾重、肌酐、尿素均无显著差异(P＞0.093)，但体重显著高于DNK组(P＜0.05)，总胆固醇及三酰甘油显著低于DNK组(P＜0.05)。血糖秩次比较，DNS与DNY比较接近，均明显低于DNK及DN组，但仍明显高于NC组。 6、与NC组大鼠肾组织病理切片比较，DN组可见肾小球体积增大，大量系膜增生，近曲小管细胞肥大、空泡样变性；DNS、DNY、DNK组肾小球系模增生减轻，肾小球体积增大明显减轻。 结论： 1、肾康丸处方A、F、C三味中药都对UAE具有显著的治疗作用，B、D、E三味中药可能起辅助作用，A与B、A与C、A与F之间的交互效应不显著，处方优化的结果，肾康丸原方为最优化处方。 2、中药肾康丸与西药开博通比较，除有相似的肾保护作用外，更能发挥多靶点的肾保护作用，显示出中药在DN的肾保护作用方面有一定的优势。 第二章肾康丸对DN大鼠肾皮质TβRⅡ的影响 目的：观察DN大鼠TβRⅡ抗原及其mRNA表达的变化，探讨肾康丸治疗DN大鼠的可能机制。 方法： 1、动物标本采集：实验末每组大鼠简单随机法取4只，解剖大鼠后，摘取肾脏，称重，去除包膜，经4℃预冷DEPC水反复冲洗肾脏，修剪肾皮质，取约0.1g于EP管，立即保存于-80℃冰箱中待测。 2、免疫组织化学染色：组织切片脱蜡至水后，经PBS冲洗，滴加10％正常山羊血清2滴，盖满组织片，室温30分钟，倾去勿洗，取一抗工作液(兔抗TβRⅡ(1∶100))75μl覆盖组织片，置洁净塑料盒盖上盖防蒸发，4℃过夜(16小时左右)，同时以PBS设置一抗阴性对照。 3、TβRⅡ抗原表达计分：每组随机选取4个切片标本，每张切片在高倍镜下随机选择10个肾小球和10个视野肾小管间质，根据染色面积和强度按法进行半定量评分，TβRⅡ阳性表达均定位于细胞质和细胞膜，以出现清晰的浅黄色—棕褐色颗粒判定为阳性，细胞核不表达。反应结果根据胞质、胞膜的着色程度计分：胞质、胞膜无着色，计0分；淡黄色为或染色面积＜25％，计1分；棕黄色或染色面积在25％～50％之间，计2分；棕褐色或染色面积＞50％，计3分。 4、RT-PCR检测TβRⅡ基因的表达：实验采用RT-PCR法，检测肾康丸对TβRⅡmRNA表达水平的影响。每组随机选取4份肾组织标本，Trizol法提取肾组织总RNA，以0.1％DEPC处理水50μl溶解后分装，加RNAin保存于-80℃冰箱。TβRⅡ、GAPDH引物序列，TβRⅡ：引物1序列为：5'GCAGAACACTTCAGAGCAGTTTG3'；引物2序列为：5'CAGGTCATCCACAGACAGAGTAGG3'；GAPDH：引物1序列为：5'AGATCCACAACGGATACATT3'；引物2序列为：5'TCCCTCAAGATTGTCAGCAA3'。取总RNA5μl加至一步法RT-PCR试剂盒20μl反应体系，再加0.3μl下游引物，70℃5分钟后置冰上加上游引物0.3μl，补加DEPC处理水至20μl，42℃，60分钟形成cDNA，94℃，5分钟，灭活逆转录酶，然后进行PCR扩增。PCR扩增条件：94℃1分钟，55℃1分30秒，72℃2分钟，72℃延伸7分钟，30个循环，TβRⅡ扩增产物长度为348bp，GAPDH扩增产物长度为309bp。取扩增产物5μl，加上样缓冲液lμl，在2.0％琼脂糖凝胶中电泳，缓冲液为0.5×TBE电泳缓冲液，恒定电压90v，80分钟。于紫外灯下拍照，将胶片上反应带在GelDoc1000凝胶成像分析系统中扫描、分析电泳带的灰度，目的基因mRNA表达量=每例标本目的基因凝胶图像平均灰度值/同一标本GAPDH凝胶图像平均灰度值。 结果： 1、大鼠肾组织TβRⅡ免疫组化：TβRⅡ抗原着色在DN、DNS、DNY、DNK组肾小球及肾小管均有不同程度表达，在NC组及一抗阴性切片上无或弱表达。就阳性着色部位言，肾小管及间质TβRⅡ抗原表达较显著，肾小球呈弱表达，肾小球与间质小管间比较差异显著(Z=-6.165，P＜0.001)。肾小球5组间比较差异显著(χ2=15.163，P=0.004)，肾小管间质五组间比较也有显著性差异(χ2=39.252，P＜0.001)，DNS、DNY、DNK组着色计分平均秩次明显低于DN组，但仍明显高于NC组，DNS、DNY、DNK三组着色计分秩次相当。 2、大鼠肾组织TβRⅡmRNA的表达：各组大鼠RT-PCR扩增产物经琼脂糖电泳，Marker标记片断为348bp和309bp，符合目的基因长度。各组间相对量比较具有显著性差异(F=94.674，P＜0.001)。TβRⅡmRNA表达DNS、DNY、DNK三组较DN组均有显著下降(P＜0.05)，DNS、DNY、DNK三组间比较无显著差异(P=0.402)，但仍显著高于NC组(P＜0.05)。 结论： 1、DN大鼠肾皮质TβRⅡ抗原表达主要定位于肾小管，肾小球表达量较少。 2、肾康丸具有显著的肾保护作用，有与血管紧张素转换酶抑制剂开博通相似的下调DN大鼠肾皮质TβRⅡ抗原及mRNA表达的效果，可能是其发挥DN肾保护作用的机制之一。

目录

文摘

英文文摘

前言

第一章 肾康丸处方正交设计法优化研究

第二章 肾康丸对糖尿病肾病大鼠肾皮质转化生长因子β2型受体表达的影响

全文小结

黄芪及其有效成份治疗DN机理研究进展

附录

在读期间发表的论文及参与申请的课题

致谢

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