利用RNAi技术研究CTSD和MMP1在鼻咽癌转移中的作用

摘要

鼻咽癌是我国南方五省及东南亚地区高发的头颈部恶性肿瘤之一，其发病的分子机制仍未阐明。目前，普遍认为EB病毒感染、遗传因素和化学致癌物是导致鼻咽癌发生的三大主要原因。 鼻咽癌的转移是导致鼻咽癌治疗失败的主要原因，但目前对于鼻咽癌转移的分子机制人们知之甚少。因此，进一步筛选和鉴定鼻咽癌转移相关基因，并明确其在鼻咽癌转移过程中的作用，对于揭示鼻咽癌转移的分子机制有着重要意义，也对鼻咽癌的治疗及预后判断具有重要的理论和实用价值。 鼻咽癌细胞5-8F和6-10B均来源于同一母细胞株SUNE-1，既往的研究已经证实，5-8F具有高成瘤、高转移能力，而6-10B则只成瘤、不转移。我们实验室利用深圳微芯公司生产的8046个点基因芯片比较了5-8F/6-10B之间差异表达基因，获得一些差异表达的基因，其中CTSD和MMP1为已知的转移相关基因，芯片的数据提示这两个基因可能在鼻咽癌的转移过程中发挥重要作用。 人CTSD基因的过度表达可促进癌细胞的生长和转移，是恶性肿瘤预后的重要指标之一。文献报道该基因的过表达与多种恶性肿瘤，如乳腺癌、大肠癌、胃癌以及前列腺癌等的转移相关，同时也有文献报道CTSD在鼻咽癌转移过程中发挥作用，但仍需进一步的实验证实其作用。 人MMP1基因在肿瘤演进的多个阶段均有作用，它影响肿瘤的起始、生长、血管生成、进入血管/离开血管等过程。流式细胞分析结果表明，转染pLentiU6空白载体的5-8F细胞与未转染的5-8F-E细胞的细胞周期分布没有明显改变；转染pLentiU6/CTSDshRNA的5-8F-EGFP细胞与未转染的5-8F-EGFP细胞比较，细胞周期也没有明显的变化。这些数据表明抑制CTSD基因的表达对鼻咽癌细胞株5-8F-EGFP细胞周期没有明显的影响。 利用Boyden侵袭小室模型比较了转染pLentiU6空白载体的5-8F-EGFP细胞与未转染的5-8F-EGFP细胞以及转染pLentiU6/CTSDshRNA的5-8F-EGFP细胞侵袭能力，结果显示转染空载体pLentiU6对肿瘤细胞的侵袭转移能力没有明显的影响，但是转染干扰载体pLentiU6/CTSDshRNA后则能够显著性的降低细胞穿过ECMatrix膜的能力。这一结果表明，抑制CTSD基因的表达能够降低鼻咽癌细胞株的侵袭转移能力。 进一步，将上述三种细胞分别原位接种到裸鼠的鼻咽部，观察它们的转移能力的变化。结果表明空载体对细胞的转移能力基本上没有影响，而抑制CTSD基因表达后，在一定程度上能降低接种动物的转移能力，但这种影响并不显著。 第二部分：利用RNAi干扰技术研究MMP1基因在5-8F-EGFP细胞中的作用 这一部分主要是观察抑制鼻咽癌细胞株5-8F-EGFP中MMP1基因的表达后对细胞的转移能力的影响，实验方法与第一部分相同。先针对靶基因MMP1构建了2个RNAi载体：pLentiU6/MMP1shRNA1和pLentiU6/MMP1shRNA2。经测序结果证实后，PCR证实外源DNA已整合到细胞基因组DNA中，荧光定量RT-PCR结果表明，pLentiU6/MMP1shRNA1和pLentiU6/MMP1shRNA2表达载体都能特异性的引起靶基因CTSD的表达下调，其中MMP1shRNA1对目的基因的干扰效果为76％，而MMP1shRNA2对目的基因的干扰效果仅为57％。进一步，WesternBlotting分析表明MMP1shRNA1片段的干扰效率为71.2％，而MMP1shRNA2片段的干扰效率只有59.4％。这些数据表明我们已成功地建立稳定转染pLentiU6/MMP1shRNA的5-8F-EGFP细胞系，并且MMP1shRNA1片段的干扰效率比MMP1shRNA2片段的干扰效率要高。 流式细胞分析抑制MMP1基因表达对5-8F-EGFP细胞周期的影响，结果显示干扰前后细胞的周期无显著改变；用MTT法测定抑制MMP1基因表达对5-8F-EGFP细胞生长的影响，结果显示干扰前后细胞的生长也无明显变化；Boyden侵袭小室实验观察抑制MMP1基因表达对5-8F-EGFP细胞穿ECMatrix膜的能力的影响，结果显示抑制MMP1基因的表达能够显著性地降低细胞穿过ECMatrix膜的能力。分别原位接种干扰前后的两种细胞到裸鼠的鼻咽部，观察两者转移能力的改变，结果显示10只接种干扰MMP1的5-8F细胞，9只原位成瘤，只有5只出现转移灶，转移率为5/9，而10接种未干扰的5-8F细胞，8只原位成瘤，8只均有转移灶出现，转移率为8/8。动物实验表明抑制MMP1基因的表达对细胞转移能力的没有显著的影响。 第三部分：用RNAi干扰技术研究同时抑制CTSD和MMP1基因对5-8F-EGFP细胞的作用 肿瘤的侵润转移是一个复杂而又连续的过程，牵涉众多的基因共同作用和调节。为研究CTSD和MMP1对鼻咽癌细胞的转移能力的影响是否同时存在作用，我们将上述实验中构建的针对CTSD和MMP1两个基因的RNAi载体通过共转染的方法导入到鼻咽癌细胞系5-8F-EGFP中，杀稻瘟菌素筛选获得抗性克隆，PCR证实外源DNA已整合到细胞基因组DNA中，WesternBlotting检了鼻咽癌的转移过程。 RNAi技术和可视化技术是近几年肿瘤研究领域发展起来的前沿技术。RNAi是研究基因功能和进行基因治疗的全新技术，更是后基因组时代进行基因功能高通量研究的强有力的工具。哈佛大学的研究者利用这一技术一次对果蝇的16000个基因进行了发育相关功能研究，从中发现了300多个与发育相关的基因，如果利用传统技术，这是无法想象的。另外由于RNAi具有高效、特异的靶向作用与沉默机制，使其成为治疗某些传统难治之症(如恶性肿瘤、AIDS等)的希望。 利用可视化技术建立的肿瘤动物模型可以帮助研究者在整体动物水平适时观察肿瘤的生长、演进和转移的情况。该技术现已广泛应用于肿瘤转移以及抗癌药物的研究等众多领域中，Hoffman领导的实验室利用可视化技术建立了一系列的MetaMouse，为药物筛选和肿瘤转移研究提供了良好的动物模型。我们实验室利用这一技术在国际上首次建成了可视化的鼻咽癌转移模型，该模型是研究鼻咽癌转移的极佳动物模型。 本研究是在前期利用芯片筛选出在高转移鼻咽癌细胞株5-8F中高表达的两个转移相关基因CTSD和MMP1的基础上，进一步利用RNAi技术和可视化动物模型技术在细胞和动物整体水平上分析这两个基因在鼻咽癌转移过程中的作用，为阐明鼻咽癌的分子机制提供直接证据。实验的方法和结果如下： 第一部分：利用RNAi干扰技术研究CTSD基因在5-8F-EGFP细胞的作用 采用pLentiU6慢病毒载体系统，构建了针对靶基因CTSD的1个RNAi载体pLentiU6/CTSDshRNA。经测序结果证实后，利用脂质体转染技术将pLentiU6/CTSDshRNA导入5-8F细胞，杀稻瘟菌素筛选获得抗性克隆，PCR证实外源DNA已整合到细胞基因组DNA中，荧光定量RT-PCR结果表明，pLentiU6/CTSDshRNA表达载体能特异性的引起靶基因CTSD的表达下调，下调效果为83％。进一步，WesternBlotting分析表明整合pLentiU6/CTSDshRNA细胞中CTSD蛋白表达下调了70％，这些数据表明我们已成功地建立稳定转染pLentiU6/CTSDshRNA的5-8F细胞系。 为观察抑制CTSD基因的表达对鼻咽癌的生物学特性和转移能力的改变，测细胞克隆中CTSD和MMP1两个基因的干扰效果，筛选出同时抑制CTSD和MMP1表达的细胞克隆。 接下来我们比较了同时抑制CTSD和MMP1基因表达的5-8F-EGFP与仅抑制MMP1基因表达以及未转染的5-8F-EGFP三种细胞在生长能力、细胞周期以及细胞的侵袭转移能力的差异，发现同时抑制CTSD和MMP1对细胞的生长能力以及细胞的周期均没有明显的影响，但对细胞的侵袭转移能力有着明显的影响。说明MMP1与CTSD基因在介导鼻咽癌的转移方面可能是同肘起作用的。 总之，我们利用RNAi技术分别和联合干扰鼻咽癌高转移细胞系5-8F细胞中CTSD和MMP1基因的表达，观察了它们对细胞的生长增殖、细胞周期以及侵袭转移能力的影响。实验结果显示无论是单独还是联合干扰CTSD和MMP1，对细胞的生长能力和细胞周期都没有明显的影响，但是对细胞的侵袭转移能力却有一定的影响，并且联合干扰两个基因的表达比仅干扰其中的MMP1一个基因的影响要大。这些结果表明CTSD和MMP1在鼻咽的转移过程中可能发挥了一定作用。实验结果对于CTSD和MMP1被选作鼻咽癌基因治疗或预后的候选靶点时可能有一定的参考价值。

目录

文摘

英文文摘

前言

实验流程

第一章 材料与方法

第二章 实验结果

第三章讨论

结论

参考文献

中英文缩略词表

致谢

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