灵芝多糖抗肿瘤作用的免疫分子机制研究

摘要

灵芝多糖GLB系从灵芝[Ganodermalucidum(LeyssexFr.Karst.)]子实体中提取的多糖组份，易溶于水。大量文献报道灵芝多糖具有免疫调节作用和抗肿瘤作用，多数研究报道认为灵芝多糖在体外没有直接的抑制或杀伤肿瘤细胞的作用，然而体内给药却具有良好的抗肿瘤作用，因此，一般认为灵芝多糖的抗肿瘤作用是通过增强免疫功能而介导的。虽然有许多学者从免疫学的角度研究了灵芝多糖的抗肿瘤机制，而且取得了较好的进展，但其确切机制仍然不是十分清楚，有待深入研究。 目的：本研究选用荷瘤小鼠及其细胞作为研究材料，尝试从Toll样受体4(TLR4)及其信号转导的角度、从拮抗前列腺素E2(PGE2)免疫抑制的角度探讨灵芝多糖的免疫学抗肿瘤机制。 方法：MTT比色法检测细胞增殖程度；ELISA方法检测肿瘤坏死因子α(TNF-α)、γ-干扰素(IFN-γ)的含量；半定量RT-PCR方法检测白细胞介素1α(IL-1α)、白细胞介素2(IL-2)、TNF-α、IFN-γmRNA的表达水平。 结果：灵芝多糖GLB在50-400μg·ml-1的浓度范围内可促进荷瘤小鼠脾细胞的增殖反应。选择GLB的亚适促增殖浓度200μg·ml-1为刺激模型，特异性大鼠抗小鼠TLR4单克隆抗体可对抗GLB的促增殖作用，在浓度为2.0μgml-1时可完全取消GLB的促增殖作用(P=0.000)。 GLB在浓度为50-200μg·ml-1的范围内可促进荷瘤小鼠脾细胞TNF-α的产生，加入抗TLR4抗体(1和2μg·ml-1)后，GLB的促进作用逐渐减弱(P=0.005，P=0.001)，但不能完全取消GLB对TNF-α的促分泌作用。 GLB(200μg·ml-1)能促进荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞产生TNF-α，抗TLR4抗体(1和2μg·ml-1)对这一促进作用也有显著的对抗作用(P=0.007，P=0.003)，但不能完全阻断；然而，p38MAPK特异性阻断剂SB203580(20μM)和NF-κB特异性阻断剂helenalin(10μM)，可以完全取消GLB促进荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞分泌TNF-α的作用(P=0.000)。 GLB增加荷瘤小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ的含量，加入抗TLR4抗体(2.0μg·ml-1)之后，其促分泌作用受到明显的抑制(P=0.000)，但不能完全取消。通过腹腔给药，GLB剂量为100和200mg·kg-1体重时，可使荷瘤小鼠血清IFN-γ的水平分别提高97.4和126.8％(P=0.000)。 在混合淋巴细胞培养反应(MLR)中，固定PGE2的浓度为20μM，在其中再加入不同浓度的GLB，培养48小时后，当GLB为100和200μg·ml-1时可部分对抗PGE2(20μM)的抑制作用(P=0.044，P=0.008)。 培养4小时后，GLB(200μg·ml-1)促进小鼠脾细胞IFN-γmRNA的表达，而PGE2(20μM)呈明显的抑制作用。当GLB为100和200μg·ml-1时可部分对抗PGE2(20μM)的抑制作用(P=0.030，P=0.000)。 培养8小时后，GLB(200μg·ml-1)可轻微促进IL-1amRNA的表达，而PGE2(20μM)抑制IL-1amRNA的表达，两者合用，GLB为200μg·ml-1的浓度时可部分对抗PGE2的抑制作用(P=0.018)。与此同时，GLB(200μg·ml-1)可以促进TNF-αmRNA的表达，相反，PGE2(20μM)产生抑制作用。两者合用，GLB(200μg·ml-1)可部分对抗PGE2对TNF-αmRNA表达的抑制作用(P=0.010)。 培养12小时后，GLB(200μg·ml-1)可以促进IL-2mRNA的表达，相反，PGE2(20μM)产生抑制作用。两者合用，GLB(200μg·ml-1)可部分对抗PGE2对IL-2mRNA表达的抑制作用(P=0.003)。 结论： 1.灵芝多糖促进荷瘤小鼠脾细胞增殖、促进TNF-α、IFN-γ产生与激动TLR4有关。 2.灵芝多糖促进TNF-α产生的信号转导机制可能是作用于巨噬细胞上的TLR4，然后经p38MAPK信号转导途径激活NF-κB，后者启动TNF-α基因转录。 3.灵芝多糖抗肿瘤作用可能与促进荷瘤小鼠产生TNF-α、IFN-γ有关。 4.灵芝多糖抗肿瘤作用与拮抗PGE2对小鼠脾细胞IL-1α、IL-2、IFN-γ和TNF-αmRNA表达的抑制作用可能有关。

目录

文摘

英文文摘

一、前言

二、材料与方法

三、结果

四、讨论

五、结论

六、参考文献

七、综述：多糖抗肿瘤作用和作用机制的研究进展

缩略词

论文发表情况

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