阻断磷脂酶C-γ1通路对肿瘤坏死因子-α诱导人胶质瘤SWO细胞凋亡的影响

摘要

神经胶质瘤(glioma)是常见的神经外胚层肿瘤，占中枢神经系统肿瘤的40％以上，临床表现包括星形胶质瘤、少突胶质细胞瘤、室管膜瘤、多形性胶质母细胞瘤等。由于其位置特殊且极易向周围脑组织浸润，恶性胶质瘤成为临床治疗最为棘手的肿瘤之一。目前，治疗胶质瘤的方法主要为手术切除配合放、化疗。但由于其浸润性生长并对放、化疗有一定的耐受性，胶质瘤患者的预后通常很差。寻找能够有效抑制胶质瘤发生发展的方法成为近年来国内外学者孜孜不倦追求的目标。 肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-alpha，TNF-α)是一种具有较强免疫活性的细胞因子，由激活的单核巨噬细胞分泌。它具备多种生理活性，如控制细胞的增殖与分化，介导组织损伤的急性反应，调节其他细胞因子(如IL、IFN、TGF等)的分泌等等。最重要的是，它能引起肿瘤细胞凋亡或坏死。其分子机制如下：TNF-α与细胞膜上的相应受体结合后，将一系列胞浆蛋白激活并募集到细胞膜内表面，形成死亡诱导信号复合物(deathinducingsignalingcomplex，DISC)，从而激活caspase家族蛋白的级联反应，最终使蛋白降解，细胞凋亡。但研究发现，包括神经胶质瘤在内的许多恶性肿瘤对TNF-α并不敏感，这与TNF-α在细胞内激活另一条抗凋亡通路有关，即TNF-α信号激活核因子-κB(NF-κB)，NF-κB进入核内启动某些抗凋亡基因的转录，从而保护细胞免于凋亡。如何拮抗TNF-α启动的抗凋亡信号，使肿瘤细胞对其更敏感，是近年来的研究热点之一，也是本课题主要探讨的问题。 磷脂酶C-γ1(phospholipaseC-γ1，PLC-γ1)是肌醇磷脂特异的磷脂酶C家族中的一员，是连接生长因子受体酪氨酸激酶及其下游信号传递分子之间的主要桥梁。当细胞膜表面的受体酪氨酸激酶被活化后，PLC-γ1的酪氨酸残基被磷酸化而激活，继而催化膜上的磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)生成甘油二脂(DAG)和三磷酸肌醇(IP3)。PLC-γ1所介导的信号通路主要参与调节细胞的生长、分化、运动等行为；它是细胞中的存活分子，对某些条件下(如氧化应激)细胞的生存非常重要。目前在许多恶性肿瘤中都发现了PLC-γ1的高表达，如乳腺癌、结肠癌、膀胱癌、前列腺癌、神经胶质瘤等，这提示PLC-γ1与肿瘤发生发展密切相关。许多研究表明，抑制PLC-γ1的活性，能降低肿瘤细胞的迁移、黏附及侵袭能力。但PLC-γ1的高表达是否与肿瘤细胞的“不死”有关，是否参与肿瘤细胞凋亡的调控，PLC-γ1所介导的通路与TNF-α通路是否存在相互干扰，有关这方面的研究还未见报道。 本课题以人胶质瘤细胞株SWO为模型，以TNF-α为诱导凋亡的因素，分别以化学阻断剂U73122及慢病毒介导的RNA干扰法阻断PLC-γ1通路，研究PLC-γ1在TNF-α诱导SWO细胞凋亡中的作用。首先，我们用四唑盐(MTT)比色法检测SWO细胞对TNF-α的敏感性，发现SWO细胞对TNF-α非常不敏感，104U/L、105U/L、2×105U/L和5×105U/L的TNF-α作用48h对SWO细胞的增殖抑制率分别为8.07％、5.18％、22.51％和26.28％；而以2.5μmol/LU73122预处理细胞后给予上述浓度TNF-α刺激，细胞增殖抑制率分别为27.43％、29.07％、29.72％和22.04％；以5μmol/LU73122预处理细胞后给予上述浓度TNF-α刺激，细胞增殖抑制率分别为28.74％、25.89％、23.95％和21.99％。可见，2.5μmol/L及5μmol/L的U73122能使较低浓度TNF-α(104U/L和105U/L)对SWO细胞的增殖抑制率大大增高，而对较高浓度的TNF-α(2×105U/L和5×105U/L)无明显影响。接着，我们采用PI单染流式细胞仪检测、DAN片段化分析及Caspase-3前体检测的方法研究抑制PLC-γ1及给予TNF-α刺激对SWO细胞凋亡的影响，结果显示2.5μmol/LU73122或104U/LTNF-α单独使用都不会引起细胞凋亡，但二者联用却能使SWO细胞发生凋亡，这说明PLC-γ1的抑制剂U73122能增加SWO细胞对较低剂量TNF-α的敏感性，即PLC-γ1在TNF-α诱导的SWO细胞凋亡中发挥负调控作用。为了进一步探讨其中的分子机制，我们采用慢病毒介导的RNA干扰法特异性敲低SWO细胞PLC-γ1表达，发现抗凋亡蛋白Bcl-2的表达亦随之下调，说明Bcl-2是PLC-γ1参与凋亡负调控的下游效应分子之一。 本课题首次研究了PLC-γ1在TNF-α诱导的SWO胶质瘤细胞凋亡中的作用，对进一步深入认识PLC-γ1与肿瘤细胞凋亡的关系、TNF-α信号通路与PLC-γ1所介导的信号通路之间的关联以及增加肿瘤细胞对TNF-α的敏感性等问题作了有益的探讨，并得出以下结论：1、阻断PLC-γ1通路，能增加SWO胶质瘤细胞对TNF-α的敏感性；2、PLC-γ1不但与肿瘤细胞的增殖、迁移、黏附有关，还参与细胞凋亡的负调控；3、PLC-γ1负调节凋亡的可能机制之一为下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。

目录

文摘

英文文摘

前言

第一部分阻断PLC-γ1通路对TNF-α抑制胶质瘤SWO细胞增殖并诱导调亡的影响

第二部分PLC-γ1负调控SWO细胞凋亡的机制探讨

全文小结

参考文献

附录一综述肿瘤坏死因子与神经胶质瘤

附录二中英文缩略词对照表

成果硕士期间发表论文

致谢

第一军医大学学位论文原创性声明及学位论文版权使用授权书及研究生毕业论文统计学审稿证明