SARS冠状病毒S2基因的克隆表达和S2蛋白抗原活性的初步研究

摘要

一、研究背景和目的 严重急性呼吸综合征(severacuterespiratorysyndrome，SARS)又称传染性非典型肺炎，是2003年新发现的一种呼吸系统传染病，其病原体是SARS冠状病毒(SARScoronavirus，SARS-CoV)。 SARS-CoV属于巢状病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(coronavir)，为单正链RNA病毒，基因组全长约29.7kb，已知编码11种蛋白，其中包括4种结构蛋白，分别是刺突蛋白(S)、包膜蛋白(M)、小包膜蛋白(E)和核蛋白或核壳体蛋白(N)。S蛋白三聚体形成突起，伸出包膜表面。S蛋白是病毒的主要表面抗原成分，具有受体结合和膜融合活性，在组织嗜性、细胞融合和毒力等方面起重要作用。N蛋白与基因组RNA结合形成核衣壳。M蛋白和E蛋白是包膜形成所必需的成分。 S蛋白是Ⅰ型膜糖蛋白，介导病毒与宿主细胞膜上的受体结合并与宿主细胞膜相融合。S蛋白由S1和S2两个亚基组成。S1形成球状部分，S2形成棒状部分，两者之间通过分子间的作用力相互结合。S1能与宿主细胞上的受体结合，S2可把整个S蛋白固定在细胞膜上，并介导病毒包膜与宿主细胞膜融合。S蛋白上有重要的病毒抗原决定簇，S基因的突变会影响病毒的致病性。 S蛋白由1256个氨基酸组成，有23个潜在的糖基化位点，其N端和C端相对保守。N端有由疏水氨基酸组成信号肽，剪切点可能位于第13或14位氨基酸，可协助病毒固定于内质网上。C端由高保守的跨膜区域和富含半胱氨酸的区域组成。S蛋白主要部分暴露于病毒的表面，这与其他冠状病毒基本一致。通过对多个国家和地区的SARS-CoV分离株S蛋白的编码基因进行同源性分析，发现SARS-CoV的S蛋白比较保守，变异率低，其中S2比S1更为保守。在二级结构上，S1区具有较多的β折叠，S2通常含有一些a螺旋两性区。S蛋白C端的a兼性区(alpha-amphipathicregion)为卷曲结构(coiled-coil)，能促进部分肽段跨过细胞膜，促使病毒包膜与宿主细胞膜融合。该兼性区约有2～3个，其中1个长为116个氨基酸，位于S蛋白的884～999aa处。研究发现，在约729～770、879～1016和1164～1185处，分别有1个螺旋区域，可能为S2蛋白中的N/M/C螺旋处，该螺旋与病毒包膜与宿主细胞膜的融合有关。 本项研究分析了在SARS流行期间不同时间、不同地点的11株SARS-CoV毒株S2基因的变异情况。结果发现，随着时间的推移，S2基因变异速度逐渐减小。在SARS流行的晚期，S2基因几乎没有变异。S2蛋白可能包含有1个内在的融合肽和2个疏水的7次螺旋区域。7次螺旋区域在MHV等病毒的融合蛋白中均有发现。研究发现，两段疏水的7次螺旋区域具有吸附与穿入活性。另有研究者预测，S2蛋白的M螺旋(884～999aa)能促进部分肽段跨过细胞膜，促使病毒包膜与宿主细胞膜融合。根据生物信息学预测，S2蛋白的M螺旋处为S2蛋白中2个7次螺旋区域中的一段。因此，本研究将靶蛋白锁定为S2和S2M蛋白(S2蛋白M螺旋471～884位核苷酸)。克隆获得SARS冠状病毒S2、S2M基因，在原核表达系统大肠杆菌中获得高效表达，对表达蛋白加以纯化，初步研究其抗原活性。 二、研究方法 1、根据GenBank提供的SARS-CoVBJ01株基因组序列(AY288478)，设计引物，以本实验室分离的GD322株基因组为模板，扩增S1、S2基因，构建克隆载体pGEM-T-S1、pGEM-T-S2，通过PCR鉴定。 2、从GenBank下载有代表性的11株SARS-CoV序列，分别输入LaserGene软件包的Editseq软件中，截取S2基因片段，并翻译成氨基酸序列。利用ClustalX软件，将扩增的S2基因与下载的11株S2基因核苷酸和氨基酸序列进行比较，并通过TreeView软件制作系统进化树。利用DNAMAN软件对S2基因进行抗原表位的预测，利用Internet数据库分析S2基因T细胞抗原表位。 3、根据GD322株S2和S2M基因序列设计引物，在引物两端分别加上EcoRI或XhoI酶切位点，以pGEM-T-S2质粒为模板，扩增S2和S2M段，连接至pGEM-T载体，得到pGEM-T-S2和pGEM-T-S2M重组克隆载体。 4、将pGEX-4T-1与pGEM-T-S2和pGEM-T-S2M分别经EcoRI/XhoI双酶切后连接，构建融合表达载体pGEX-4T-1-S2和pGEX-4T-1-S2M，转化宿主菌BL21，通过双酶切及PCR鉴定后测序。 5、利用IPTG诱导表达目的蛋白，SDS-PAGE电泳及Western-Blot鉴定表达蛋白。 6、优化表达条件，实现融合蛋白的可溶性表达，通过GST亲和层析柱纯化S2和S2M蛋白。 7、利用间接ELISA法，将表达蛋白与SARS阳性病人血清进行反应，检测表达蛋白的活性。 8、利用间接ELISA法将表达蛋白与从医院随机收集的非SARS病人血清及普通冠状病毒OC43、229E免疫兔血清进行反应，分析纯化蛋白是否与普通冠状病毒OC43、229E有共同抗原成分，分析S2和S2M蛋白的特异性。 9、将VeroE6、BHK-21细胞分别裂解，与纯化蛋白进行ELISA反应，了解细胞表面是否存在可以识别S2蛋白的受体。 三、研究结果 1、RT-PCR扩增及克隆SARS-CoVGD322株S1、S2基因，S1基因全长2163bp，S2基因全长1605bp，与SARS-CoVBJ01株S1基因同源性为99.88％，与S2基因同源性为99.92％。结果已登录GenBank，S2基因登录号为AY707461，S1基因登录号为DQ407820。以S2基因为模板，扩增并克隆S2M基因。 2、使用ClustalX软件对12株不同时期、不同地区分离的SARS-CoVS2基因进行比对分析，并使用TreeView软件构建系统进化树。发现早期分离株之间存在的差异大于0.3％，中期分离株之间的差异小于0.1％，晚期分离株同部分中期分离株之间的差异小于0.1％。 3、通过Internet网上数据库，对12株SARS-CoVS2蛋白氨基酸序列进行T细胞抗原表位预测，发现只存在一处T细胞抗原表位的改变。早期分离株的第57位氨基酸为D，其余各株均为Y，该氨基酸的改变可引起T细胞抗原表位的改变。 4、通过优化表达条件，pGEX-4T-1-S2和pGEX-4T-1-S2M可在大肠杆菌中高效表达融合蛋白，分子量分别是85KDa和41KDa。表达融合蛋白以可溶性蛋白的形式分泌在细胞质中。融合蛋白含有GST标签，有利于纯化。 5、通过GST亲和层析纯化后，得到具有生物活性的目的蛋白。 6、纯化蛋白S2可与SARS阳性病人血清反应，也可同普通冠状病毒229E免疫兔血清发生交叉反应，但不与正常人血清反应，也不与普通冠状病毒OC43免疫兔血清反应。纯化蛋白S2M可与SARS阳性病人血清反应，但不与正常人血清反应，也不与普通冠状病毒OC43、229E免疫兔血清反应。 7、纯化蛋白S2可与VeroE6细胞裂解产物发生反应，也可与BHK-21细胞裂解产物发生反应。但S2M不与上述细胞裂解产物发生反应。 四、结论 1、生物信息学分析结果提示，随着SARS的流行，S2基因变异存在一定的规律。 2、成功构建原核重组表达质粒pGEX-4T-1-S2和pGEX-4T-1-S2M，经诱导后，可以在上清中表达融合蛋白，分子量分别为85KDa和41KDa。 3、S2和S2M融合蛋白具有良好的抗原活性。S2蛋白与229E病毒颗粒存在共同抗原成分，而S2M蛋白与OC43和229E病毒颗粒不存在共同抗原成分。 4、纯化的S2蛋白可与VeroE6和BHK-21细胞裂解产物发生反应，提示该细胞上存在S2蛋白的结合位点。S2M蛋白不能与上述细胞裂解物反应，提示细胞上可能不存在S2M结合位点或S2M蛋白构象发生了改变。

目录

文摘

英文文摘

前言

第一部分SARS冠状病毒GD322株S基因序列测定及分析

第二部分SARS冠状病毒S2、S2M区的表达及鉴定

第三部分SARS冠状病毒S2M蛋白的纯化及抗原活性的初步研究

第四部分SARS冠状病毒S2蛋白和S2M蛋白在病毒入侵宿主细胞时作用的初步研究

参考文献

附 综述 SARS冠状病毒S蛋白研究进展

缩略语词汇表

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