利用噬菌体肽库技术筛选SARS冠状病毒N蛋白B细胞表位的研究

摘要

研究背景与目的：SARS的流行给人民的身体健康和社会经济发展带来了巨大的威胁。目前对SARS尚无特效的治疗措施，80％的患者在前两个阶段，即病毒复制期和超敏反应期，经过及时有效的器械辅助及药物治疗后可出现好转，并最终治愈。由于该病是新近发生的传染病，造成的危害已远远超出了疾病本身的范畴，有关的发病机制、诊断及防治等方面的深入研究均是急需解决的问题。 核衣壳(N)蛋白是SARS冠状病毒(SARS-CoV)重要的结构蛋白，位于SARS-CoV的核心，由422个氨基酸组成，分子量约46kDa。N蛋白在宿主细胞质中合成后迅速磷酸化，并和包膜蛋白的羧基末端与病毒基因组RNA结合形成核衣壳。综合目前对N蛋白的研究成果，可知N蛋白广泛分布在SARS病人的多个器官和组织，其基因组序列基本保守，具有良好的抗原性。研究表明针对N蛋白的抗体产生早，引起的免疫反应强烈而持久，所以N蛋白不仅是SARS疫苗的候选分子，而且是良好的可应用于病毒感染早期诊断的靶抗原。 本实验室曾用灭活的SARS全病毒免疫小鼠，并通过一系列的筛选和配对试验，得到88株亲和力高、特异性强的抗SARS-CoVN蛋白的单克隆抗体。本研究拟选择这些单克隆抗体与N蛋白进行ELISA配对试验，鉴定出针对N蛋白不同表位的单克隆抗体，然后利用这些单抗采取ELISA夹心法亲和筛选噬菌体随机十二肽库，最后通过测序分析得到N蛋白的不同表位，然后绘制表位图。为SARS的早期诊断及SARS基因工程疫苗的研制奠定基础。 方法：利用本实验室提供的抗SARS-Cov的单克隆抗体与SARS病毒N蛋白进行配对试验，以不同表位的单抗作为固相筛选分子包被96孔板亲和筛选噬菌体随机十二肽库，经过3～5轮的筛选后在LB-IPTG/Xgal平板上随机挑取分隔良好的克隆，分别进行夹心ELISA(酶联免疫吸附试验)试验，阳性克隆在排除交叉反应后提取噬菌体单链DNA，经过0.7％琼脂糖电泳鉴定后进行测序，按照测得的DNA序列推导出其氨基酸序列(DNA序列的测定采用Biolabs公司提供的自动测序引物：5'-HOCCCTCATAGTTAGCGTAACG-3')，得到的序列再与原始N蛋白序列进行比较分析得出N蛋白的保守肽段，即为N蛋白的表位。本实验利用合成肽对N蛋白表位进行了鉴定，其肽的合成由北京塞百盛生物技术有限公司合成。 结果：对纯化效果较好的9株抗SARS-CoVN蛋白的单克隆抗体经过ELISA配对筛选后得到4株(mAbC008、mAbC039、mAbC011、mAbC005)针对N蛋白不同表位的单抗，以这些单克隆抗体作为固相筛选分子亲和筛选噬菌体随机十二肽库，经过3～5轮的筛选后在LB-IPTG/Xgal平板上随机挑取分隔良好的各46个克隆，经过ELISA夹心法鉴定出mAbC00835个阳性、mAbC03941个阳性、mAbC01128个阳性、mAbC00525个阳性克隆，对这些阳性噬菌体克隆进行与封闭液的交叉反应试验后，分别确定出各有33株、37株、22株和20株阳性克隆。将这些阳性噬菌体克隆再以碘化钠溶液抽提噬菌体单链DNA，琼脂糖凝胶电泳鉴定后测序，按照测得的DNA序列推导出其氨基酸序列，得到的序列再与原始N蛋白序列进行比较分析得出N蛋白的保守肽段，即以mAbC008作为固相筛选分子，GLXXXTPXXGXT占阳性总数的62.8％，其第1、3、5、6、11和12位置上的氨基酸残基和SARS病毒N蛋白137～148位氨基酸序列(GALNTPKDHIGT)有较高的同源性，说明12肽序列中这些位置上的氨基酸残基高度保守，可能是该抗原的一个表位骨架结构；以mAbC039作为固相筛选分子，TTLPXXXXAXXX占阳性总数的94.1％，其第1、2、3、4、9位置上的氨基酸残基与SARS病毒N蛋白165～176位氨基酸序列(TTLPKGFYAEGS)有较高的同源性，可能是该抗原表位的另一骨架结构；以mAbC011作为固相筛选分子的为PXXXXXWXTXXT占阳性总数的63.2％，其第1、7、9、12位置上的氨基酸残基与SARS病毒N蛋白46～57位氨基酸序列(PNNTASWFTALT)有较高的同源性，可能是该抗原的又一表位骨架结构；以mAbC005作为固相筛选分子的为XXXXLSPXXXFX占阳性总数的55％，其第5、6、7、11位置上的氨基酸残基与SARS病毒N蛋白100～111位氨基酸序列(KMKELSPRWYFY)有较高的同源性，可能也是该抗原的又一表位骨架结构。 结论：利用ELISA法配对筛选出4株针对不同表位抗SARS-CoVN蛋白的单克隆抗体，用这些单抗作为固相筛选分子亲和筛选噬菌体随机十二肽库，成功得到了4个N蛋白的不同表位，即以mAbC008、mAbC039、mAbC011、mAbC005作为固相筛选分子的表位分别是：GLXXXTPXXGXT、TTLPXXXXAXXX、PXXXXXWXTXXT和XXXXLSPXXXFX，其中TTLPXXXXAXXX与YuxianHe(2004)报道的SARS病毒N蛋白的一个优势表位相符，另外几个表位为国内外首次报道；本实验先用以mAbC008作固相筛选分子得到的GALNTPKDHIGT表位和以mAbC039作固相筛选分子得到的TTLPKGFYAEGS表位进行肽的合成，用竞争抑制试验对表位进行鉴定，结果显示，合成肽能很好的与相应单抗结合，能在一定程度上抑制阳性噬菌体克隆与N蛋白的结合，也能在一定程度上抑制相应单抗与N蛋白的结合，抑制效果TTLPKGFYAEGS表位优于GALNTPKDHIGT表位，说明TTLPKGFYAEGS表位可能是N蛋白的一个优势表位。本研究结果为SARS致病机制、诊断及防治等研究奠定了一定基础，具有潜在的应用价值。

目录

文摘

英文文摘

前言

材料和方法

结果

讨论

小结

参考文献

附录

攻读学位期间成果

致谢

学位论文原创性声明及版权使用授权书