严重腹腔感染时肠黏膜β连环蛋白、T细胞因子4、溶菌酶与肠上皮干细胞增殖分化机制关系的实验研究

摘要

目的：本研究以腹腔感染不同时期的大鼠小肠为研究对象，观察小肠黏膜β连环蛋白、T细胞因子4、溶菌酶的时空变化规律和分布特征，探讨β连环蛋白、T细胞因子4基因转录、翻译水平的网络调控机制对小肠上皮干细胞的增殖发育可能发挥的生物学作用。 方法：健康成年Wistar大鼠40只，体质量(250±20)g。随机分为对照组(仅行单纯剖腹手术)、感染后12、24、48小时4组，每组10只。采用盲肠结扎加穿孔法(Cecal ligation plus puncture，CLP)制作严重腹腔感染模型，分别于CLP术后12、24、48小时处死，取距回盲部10cm处回肠组织4cm作检测：2cm加入10％中性甲醛溶液中固定2小时，用于HE染色和免疫组织化学检测β-连环蛋白、T细胞因子4、溶菌酶。另2cm标本及时投入液氮罐，-70℃保存，待行RT-PCR检测β-连环蛋白、T细胞因子4。实验数据以均数±标准差(x±s)表示，采用完全随机设计资料的方差分析，SPSS11.5软件进行统计学处理。 结果：(1)HE染色形态学显示，对照组光镜下小肠黏膜各层结构完整，肠绒毛排列整齐；实验组光镜下小肠黏膜和黏膜下层间质水肿、血管充血，黏膜层有中性粒细胞浸润，肠绒毛毛细血管充血，部分区域有黏膜上皮脱落，浆膜层明显炎性渗出。 (2)应用RT-PCR方法扩增感染后不同时期的β连环蛋白、T细胞因子4基因，结果显示术后12小时mRNA水平迅速上升，与对照组比较分别为(0.74±0.10 vs 0.52±0.06，P<0.01)、(0.21±0.01 vs 0.19±0.01，P<0.01)；在术后24小时mRNA水平达到峰值，与对照组比较分别为(0.90±0.09 vs 0.52±0.06，P<0.01)、(0.28±0.02 vs 0.19±0.01，P<0.01)；随后表达量逐渐下降，48小时mRNA表达量仍显著高于对照组，即(0.80±0.09 vs 0.52±0.06，P<0.01)、(0.20±0.01 vs 0.19±0.01，P<0.05)。 (3)免疫组织化学显示，比较手术前后大鼠小肠隐窝中β连环蛋白、T细胞因子4、溶菌酶的表达，见正常组织中β连环蛋白、T细胞因子4、溶菌酶表达较弱；而术后12小时肠隐窝中β连环蛋白、T细胞因子4、溶菌酶阳性细胞明显增多，与对照组比较分别为(145.70±8.31 vs 134.80±10.56，P<0.05)、(73.20±11.23 vs 49.00±10.45，P<0.01)、(74.70±7.32 vs 65.80±5.83，P<0.05)；24小时后表达最强，与对照组比较分别为(178.20±10.51 vs 134.80±10.56，P<0.01)、(112.00±11.60 vs 49.00±10.45，P<0.01)、(83.70±8.27vs 65.80±5.83，P<0.01)；随着时间的延长，β连环蛋白、T细胞因子4、溶菌酶表达逐渐降低，到48小时小肠隐窝仍有表达，与对照组比较分别为(146.60±9.92 vs 134.80±10.56，P<0.05)、(63.70±11.04 vs 49.00±10.45，P<0.01)、(76.70±7.75 vs 65.80±5.83，P<0.01)。经统计学分析显示手术前后β连环蛋白、T细胞因子4、溶菌酶表达差异具有显著的意义。 结论：从小肠组织内β连环蛋白、T细胞因子4、溶菌酶的时空变化规律和分布特征来看，它们可能与小肠黏膜干细胞增殖分化密切相关。 (1)β连环蛋白与严重腹腔感染时肠黏膜的损伤修复密切相关。严重腹腔感染Wistar大鼠肠黏膜上皮损伤后β连环蛋白表达增高，而且损伤初期β连环蛋白水平上升迅速，可能与Wnt/β-catenin途径及酪氨酸残基的磷酸化与去磷酸化的调节有着密切联系，导致肠上皮干细胞的增殖分化活性增强，从而促进肠黏膜损伤修复。 (2)T细胞因子4可在一定程度上反映肠上皮干细胞增殖状态，检测T细胞因子4表达变化即可反映肠黏膜上皮损伤修复状况。 (3)溶菌酶在潘氏细胞的表达可作为肠上皮干细胞增殖分化的标志。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

前言

材料与方法

1、主要试剂和仪器

2、主要试剂配制

2.1 RCR电泳的试剂配制

2.2免疫组化试剂配制

3、实验动物模型的建立和标本取材

3.1实验动物

3.2严重腹腔感染模型制作

3.3动物分组及标本制备

4、指标检测及方法

4.1小肠黏膜组织β-cat，Tcf-4 mRNA表达量的测定

4.2小肠组织β-cat，Tcf-4，LZM免疫组化的测定

5、图象分析

6、统计学处理

实验结果

1、大鼠严重腹腔感染模型

2、肠黏膜病理改变

3、严重腹腔感染时肠黏膜β-cat的表达结果

3.1严重腹腔感染不同时期β-cat蛋白在隐窝中的免疫组化染色

3.2严重腹腔感染不同时期β-cat基因在隐窝中的表达结果

4、严重腹腔感染时Tcf-4在小肠隐窝中的表达结果

4.1严重腹腔感染不同时期Tcf-4蛋白在隐窝中的免疫组化染色

4.2严重腹腔感染不同时期Tcf-4基因在隐窝中的表达结果

5、严重腹腔感染时LZM在小肠隐窝Paneth细胞中的表达

讨论

1、肠上皮干细胞的特性

2、Wnt/β-catenin通路

3、严重腹腔感染时β-cat与肠上皮干细胞增殖分化机制的关系

4、严重腹腔感染时Tcf-4在小肠隐窝中的表达变化及意义

5、严重腹腔感染时LZM在小肠隐窝Paneth细胞中表达变化及意义

主要结论

参考文献

附录

攻读学位期间发表论文及参研课题

致谢