从脂肪抽吸物的脂质和液体部分提取脂肪来源干细胞的细胞生物学研究

摘要

背景: 组织工程技术的出现为临床上彻底解决组织缺损等难题提供了一条革命性的途径。然而如何获得来源广泛、数量充足、功能良好的细胞，是解决种子细胞问题的关键。 继骨髓基质细胞之后，吸脂来源的人脂肪组织来源的干细胞(Adiposederived stem cells，ASCs)成为当今干细胞研究领域的又一热点。脂肪组织作为干细胞来源的原因之一是由于从脂肪组织提取干细胞取材容易，量大、可反复取材、损伤较小、细胞增殖快速、能反复分裂而不衰老等优点，且可以把抽脂术中过去弃之的脂肪组织悬液变为人干细胞库的重要来源，可作为多种组织工程的种子细胞，具有非常重要的研究和应用价值。 脂肪抽吸物中包含脂质和液体两部分。其中脂质部分已经被广泛证实能成功分离培养出具有骨、软骨、脂肪、肌肉等多向分化潜能的干细胞(ASCs)。液体部分其主要组成包括外周血液及来源于脂肪组织的细胞和组织碎片。而液态脂肪抽吸物中是否也包含类似的干细胞?同时从二者间提取的干细胞在量和质等方面有何差异?至今国内尚未见有相关报道。了解和认知这些问题对解决种子细胞来源和高效目的细胞的培养有着重要的意义。本实验尝试从脂肪抽吸物的液体部分分离、培养ASCs，并对ASCs进行活性鉴定，同时对从脂质及液体部分来源的ASCs进行生长动力学、形态学、细胞衰老、表面标志物和分化能力五个方面的鉴定比较，为完善ASCs相关研究及探索ASCs获得的新方法提供实验依据。 目的： 1．以人脂肪抽吸物中的ASCs为脂肪组织工程的种子细胞，探索和比较从人脂肪抽吸物中脂质及液体部分分离、体外培养ASCs的新方法，以及定向诱导分化(成脂肪细胞、成骨细胞)的能力。 2．脂质及液体部分来源的ASCs通过对其生长动力学、形态学、分化能力、细胞衰老和表面标记物五个方面的特征进行鉴定比较，为其广泛应用于组织工程提供实验依据。 方法： 将抽脂术后抽吸物分解为脂质和液体两部分。脂质和液体部分分别用酶消化法和直接离心过滤法分离、培养ASCs，观察其在体外培养的形态学和生物学特点；MTT比色法测细胞活性并绘制细胞生长曲线，统计学分析；流式细胞仪测定细胞周期；随机选取3、4、6、8代做丫啶橙染色检测细胞的衰老；用流式细胞仪、免疫组织化学染色法鉴定其表面分子表达；第4代的细胞进行成脂、成骨定向诱导分化，油红“O”染色、茜素红染色定性。 结果： 从吸脂抽吸物的脂质和液体两部分中都能培养出大量的ASCs，分别为PLA细胞和LAF细胞。这两种来源的ASCs在细胞形态学、生物学、细胞衰老、表面标记物的表达及分化能力几个方面的特性非常相似，且这两种来源的AScs在细胞量和质上都基本相同。MTT测定细胞活性及流式细胞仪测定这两种细胞的细胞周期均显示：PLA、LAF这两种细胞的活力与增殖能力是非常相似的，在接种第2d活性最高，都处于活跃状态；丫啶橙染色3、4、6、8代均无明显衰老；流式细胞仪鉴定：在第3、4、5代的PLA、LAF细胞中细胞大多数表达CD44、CD29阳性，CD34在第2代细胞中明显表达阳性，在第4、5代中表达则明显减弱，两种贴壁的细胞群的表达表现非常相似；免疫化学染色鉴定：Ⅷ因子、CD31、CD34、CD105、SMA为阳性表达。成脂诱导分化两周，可见细胞内有大量脂滴，油红“O”染色可见胞浆内有大量红染颗粒；成骨诱导分化两周可肉眼看到白色矿化的颗粒状钙盐沉积，经茜素红染色鉴定可发现成骨细胞及钙盐沉积被红染。 结论： 本实验建立了一种自人体脂肪抽吸物中脂质和液体部分分离和培养ASCs的新方法，经济简便实用，从成人脂肪抽吸物液体部分中也可以分离得到大量的可为脂肪组织工程所利用的ASCs，其细胞量与脂质来源的ASCs的量基本相同。贴壁的LAF与PLA细胞在细胞的生长动力学、形态学、细胞衰老、表面标志物和分化能力等方面具有非常相似的特性，都具有很强的增殖活性且不易衰老，能稳定表达干细胞表面标志并能实现定向成脂、成骨多向诱导分化。这种经过最小限度人工干预的ASCs可能是将来脂肪组织工程比较理想的种子细胞。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：中英文缩略词对照表

声明

第一章从脂肪抽吸物的脂质部分提取脂肪组织来源干细胞并定向诱导分化的实验研究

前言

材料和方法

实验结果

讨论

参考文献

第二章从脂肪抽吸物的液体部分提取脂肪组织来源干细胞并定向诱导分化的实验研究

前言

材料和方法

实验结果

讨论

参考文献

第三章脂肪抽吸物的脂质和液体部分来源的脂肪组织来源干细胞的细胞生物学比较

前言

材料和方法

实验结果

讨论

参考文献

全文结论

综述　脂肪组织的组织工程再生

攻读学位期间的成果

致谢