睾丸Sertoli细胞免疫豁免机制的研究及对大鼠同种心脏移植的影响

摘要

免疫豁免概念的提出已经有一百多年的历史,机体的某些器官,如脑、眼、角膜、卵巢、胎盘等,不受免疫系统的干扰和排斥,称为免疫豁免器官。对免疫豁免机制的研究,有可能找到使移植的细胞、组织和器官突破同种甚至异种移植免疫屏障的新方法,具有广阔的临床应用前景和潜在的巨大经济效益；加强对免疫豁免机制的研究,将使器官移植摆脱免疫抑制剂的束缚,而使病人长期存活。
　　 国内外目前对睾丸支持细胞(Sertolicells,Sc)免疫豁免机制的研究才刚刚起步。初步研究发现睾丸Sertoli细胞能产生细胞因子FasL(Fas的配体,属肿瘤坏死因子家族)和TGF-β1(TransformingGrowthFactor-β1,转化生长因子β1),这两种细胞因子可能与睾丸Sertoli细胞产生免疫豁免功能有关。因此我们开展了对睾丸Sertoli细胞免疫豁免机制的进一步研究,并探讨Sertoli细胞对同种心脏移植免疫排斥反应及细胞凋亡的影响。
　　 本研究目的:
　　 1、探讨睾丸Sertoli细胞分离纯化方法,检测睾丸Sertoli细胞FasL、TGF-β1的表达率；
　　 2、将Sertoli细胞与异基因T淋巴细胞共同培养,观察Sertoli细胞对异基因T淋巴细胞的毒性作用；
　　 3、观察Sertoli细胞对异基因T淋巴细胞凋亡的影响；
　　 4、制作同种异体大鼠腹腔异位心脏移植动物模型,在移植心脏种植与供心同基因Sertoli细胞,掌握制作大鼠腹腔异位心脏移植动物模型的外科技术；
　　 5、对种植Sertoli细胞的移植心脏与未种植Sertoli细胞的移植心脏,比较两组急性排斥反应(AcuteRejection,AR)、心肌细胞凋亡指数(ApoptosisIndex,AI)、心肌内Fas(Factorassociatedsuicide,自杀相关因子,又称CD95或APO-1)mRNA、FasLmRNA、TGF-β1mRNA的表达,并进行相关分析,明确Sertoli细胞对心脏移植免疫学影响,探讨Sertoli细胞对同种异体移植心脏是否具有免疫豁免作用。
　　 实验一、Sertoli细胞的分离纯化及其免疫豁免机制的研究一、目的1、探讨大鼠睾丸Sertoli细胞分离提纯方法,检测Sertoli细胞FasL、TGF-β1的表达百分率；
　　 2、将大鼠睾丸Sertoli细胞与异基因T淋巴细胞共同培养,观察Sertoli细胞对异基因T淋巴细胞的毒性作用；
　　 3、观察大鼠Sertoli细胞对共同培养的异基因T淋巴细胞凋亡的影响。
　　 二、方法
　　 1、Wistar大鼠Sertoli细胞的制备。2、SD大鼠T淋巴细胞制备。3、免疫组化SABC法检测Wistar大鼠Sertoli细胞FasL、TGF-β1的表达。4、不同数量的Wistar大鼠Sertoli细胞对SD大鼠T细胞的毒性作用。5、不同共培养时间Wistar大鼠Sertoli细胞对SD大鼠T细胞的毒性作用。6、Wistar大鼠Sertoli细胞对SD大鼠T淋巴细胞毒性作用机制的研究。7、Wistar大鼠Sertoli细胞促进SD大鼠T淋巴细胞凋亡机制的研究。
　　 三、结果
　　 1、Wistar大鼠每个睾丸可以分离产生睾丸细胞(2.68±0.29)×107个；细胞的存活率达(94.15±2.23)％；睾丸细胞FasL表达率为(91.65±1.63)％；睾丸细胞TGF-β1表达率为(89.20±2.16)％。
　　 2、随Wistar大鼠Sertoli细胞数量的增加,对SD大鼠T淋巴细胞的毒性作用增大。
　　 3、Wistar大鼠Sertoli细胞对SD大鼠T淋巴细胞毒性作用,随着培养时间延长其毒性作用增大,但超过3天后,其毒性作用不再增大,而维持在高水平。
　　 4、抗FasL单克隆抗体和抗TGF-β1单克隆抗体,分别能减弱Wistar大鼠Sertoli细胞对SD大鼠T细胞的毒性作用。
　　 5、抗FasL单克隆抗体和抗TGF-β1单克隆抗体,分别能减弱Wistar大鼠Sertoli细胞诱导SD大鼠T细胞凋亡的作用,但不能完全阻断T细胞凋亡。
　　 四、结论：
　　 1、2～3周龄Wistar大鼠睾丸含有丰富的Sertoli细胞；
　　 2、Wistar大鼠睾丸Sertoli细胞高度表达FasL和TGF-β1两种细胞因子；
　　 3、Wistar大鼠Sertoli细胞对SD大鼠T细胞的毒性作用,随着数量的增加其毒性作用增大；当Sertoli细胞与T细胞之比(效靶比)为1/1时,毒性作用达到高峰,效靶比超过1/1时,其毒性作用不再增加,而维持在高水平。
　　 4、Wistar大鼠Sertoli细胞对SD大鼠T细胞的毒性作用,共培养3天时效应最显著,超过3天后,其毒性作用不再增加,而保持在高水平。
　　 5、Wistar大鼠Sertoli细胞对SD大鼠T细胞的毒性作用,是Sertoli细胞表达的FasL和TGF-β1两种细胞因子产生的生物学效应；Wistar大鼠Sertoli细胞的培养基上清液对SD大鼠T细胞具有细胞毒性,可能与Wistar大鼠Sertoli细胞产生的可溶性细胞因子,如sFasL有关。
　　 6、Wistar大鼠Sertoli细胞能够诱导SD大鼠T细胞凋亡,是Sertoli细胞表达的FasL和TGF-β1两种细胞因子产生的生物学效应；Wistar大鼠Senoli细胞的培养基上清液能诱导SD大鼠T细胞凋亡,可能与Wistar大鼠Sertoli细胞产生的可溶性细胞因子,如sFasL有关。
　　 实验二、供心种植Sertoli细胞的大鼠心脏移植动物模型的制作
　　 一、目的：
　　 制作Wistar至SD大鼠腹腔异位心脏移植动物模型,并在移植心脏种植与供心同基因Sertoli细胞,掌握制作大鼠腹腔异位心脏移植动物模型的外科技术。
　　 二、方法
　　 制作Wistar至SD大鼠腹腔异位心脏移植动物模型40例,随机分成T1组和T2组,每组20例。
　　 三、结果
　　 1、心脏移植例存活34例,T1组成功18例,失败2例；T2组成功16例,失败4例；总体移植成功率85.0％。
　　 2、T1组与T2组比较,经t检验分析显示,供心摘取时间、心脏灌注及修剪时间、主动脉吻合时间、肺动脉吻合时间、供心冷缺血时间、术中出血量、手术总时间的差异无统计学意义(P>0.05)。
　　 四、结论
　　 1、必要的显微外科训练是大鼠心脏移植动物模型制作成功的基础；模型制作过程中适当深度的麻醉、良好的心脏灌注、尽可能短的缺血时间、彻底的止血、适量液体的补充和良好的肝素化是大鼠心脏移植动物模型制作成功的关键。
　　 2、T1组和T2组供心摘取时间、心脏灌注及修剪时间、主动脉吻合时间、肺动脉吻合时间、供心冷缺血时间、术中出血量、手术总时间的差异不显著,表明制作大鼠心脏移植物模型的条件是一致的,排除了人为因素对实验条件稳定性的影响。
　　 实验三供心种植Sertoli细胞对大鼠心脏移植急性排斥反应和心肌细胞凋亡的影响
　　 一、目的
　　 1、检测供心种植Sertoli细胞的大鼠组,移植心脏急性排斥反应(AcuteRejection,AR)、心肌细胞凋亡指数(apoptosisIndex,AI)、心肌FasmRNA、FasLmRNA、TGF-β1mRNA的表达变化；与供心未种植Sertoli细胞的大鼠组进行比较；探讨Sertoli细胞对移植心脏的免疫学影响。
　　 2、比较供心种植Sertoli细胞的大鼠组和供心未种植Sertoli细胞的大鼠组移植心脏存活时间,并观察移植心脏排斥反应。探讨Sertoli细胞对同种异体移植心脏是否具有免疫豁免作用。
　　 二、方法
　　 1、实验分组心脏移植动物模型来源于实验二,实验二T1组手术成功18例,T2组手术成功16例。
　　 2、样本及数据采集。
　　 三、结果
　　 1、荧光显微镜追踪观察移植的Serrtoli细胞
　　 2、A组和B组的急性排斥反应(AR)和心肌细胞凋亡指数(AI)的比较和相关分析。
　　 3、A组和B组FasmRNA、FasLmRNA、TGF-β1mRNA表达量的比较。表明种植Sc细胞的B组FasLmRNA和TGF-β1mRNA的表达显著增加。
　　 4、种植Sertoli细胞的B组内FasLmRNA、TGF-β1mRNA与AR、心肌细胞AI的相关分析。
　　 5、C组和D组移植心脏存活时间及AR的比较。
　　 四、结论
　　 1、CFSE荧光探针对Sertoli细胞的标记和示踪效果良好；
　　 2、种植Sertoli细胞显著减轻移植心脏急性排斥反应和心肌细胞凋亡；
　　 3、急性排斥反应与心肌细胞凋亡成显著正相关；
　　 4、移植心脏种植Sertoli细胞显著增加FasLmRNA表达和TGF-β1mRNA表达,不能增加FasmRNA的表达；
　　 5、移植心脏种植Sertoli细胞组,急性排斥反应、细胞凋亡分别与FasLmRNA、TGF-β1mRNA的表达成显著负相关。
　　 6、移植心脏种植Sertoli细胞组与移植心脏未种植Sertoli细胞组比较,种植Sertoli细胞显著延长移植心脏存活时间；

目录

文摘

英文文摘

第1章 研究背景

第2章 Sertoli细胞的分离纯化及其免疫豁免机制的研究

2.1 材料与方法

2.2 结果

2.3 讨论

2.4 结论

2.5 参考文献

2.6 附图

第3章 供心种植sertoli细胞的大鼠心脏移植动物模型的制作

3.1 材料与方法

3.2 结果

3.3 讨论

3.4 结论

3.5 参考文献

3.6 附图

第4章 供心种植Sertoli细胞对大鼠心脏移植急性排斥反应与心肌细胞凋亡的影响

4.1 材料与方法

4.2 结果

4.3 讨论

4.4 结论

4.5 参考文献

2.6 附图

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