腺病毒介导的CD-TK融合基因联合GCV和/或5-Fc对人膀胱癌的治疗作用

摘要

研究背景：膀胱移行细胞癌(transitional-celltumorTCC)是泌尿系统最常见的恶性肿瘤。其发生率在人体肿瘤发生率中男性为第4位，女性为第8位。美国每年新增膀胱癌患者约50.000人。膀胱癌在诊断时有75-80％为未侵犯膀胱肌层的表浅性TCC。表浅性TCC首选采用经尿道膀胱肿瘤电切术(TURBt)进行治疗。若仅行电切术，其术后有50％-70％患者将在一年内复发，且复发肿瘤中10％-15％会向膀胱肌层浸润发展成为浸润性TCC。30％浸润性TCC患者将在2年内死亡。 为预防表浅性TCC电切术后复发，术后进行膀胱内灌注丝裂霉素、卡介苗等药物是最简单、有效且常用的一种方法。灌注治疗后，表浅性TCC电切术后复发率可以下降20％左右，但复发率仍有30％-50％，且不论采取何种预防治疗措施，10-15％向膀胱肌层浸润发生率不会改变。因此临床上渴望有新的治疗措施来更有效的治疗TCC。 基因治疗的出现与发展，为人们最终战胜TCC带来了希望。在肿瘤基因治疗诸多策略中，向肿瘤细胞导入“自杀基因(suicidegene)”并激活肿瘤细胞自杀的治疗策略倍受重视。 单纯疱疹病毒(Herpessimplexvirus，HSV)胸苷激酶(Thymidinekinase，TK)基因(HSV-TK基因)和大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(E.colicytocinedeaminase，CD)基因是最常用的两种自杀基因。若能将HSV-TK基因或CD基因导入肿瘤细胞中并使之有效地表达，就可以用丙氧鸟苷(ganciclovirGCV)、无环鸟苷(acyclovirACV)或5-氟胞嘧啶(5-flurocytosine5-Fc)直接杀伤肿瘤。用该类基因治疗肿瘤还存在“旁观者效应(bystandereffect)”，即TK/GCV或CD/5-FC不仅能杀死转导了该基因的肿瘤细胞，而且能杀死周围部分未转导该基因的肿瘤细胞。 目前应用HSV-TK或CD基因治疗膀胱癌的研究正在进行当中。1997年2月美国SuttonMA等最先报道了用腺病毒载体介导TK基因转染并联合GCV治疗鼠膀胱癌取得成功，预示着良好的应用前景。此后FreundCT、MoonDG、AkasakaS等先后发表了类似的研究论文。而ZhangZ等利用CD/5-FC系统研究膀胱癌的治疗也取得了较好的效果。TrinhQT、RogersRP、RogulskiKR等的研究显示不同的肿瘤细胞对不同自杀基因有不同敏感性，在应用自杀基因治疗各种肿瘤时可能存在肿瘤细胞特异性。为充分发挥自杀基因作用，部分学者已利用CD-TK双自杀基因融合基因治疗肿瘤，其中在脑胶质瘤、肝癌、卵巢癌等肿瘤中已得到部分应用并取得较好效果，在泌尿系统肿瘤特别是前列腺癌的治疗中也已进行了较多研究，部分已进行到临床一期实验。但目前尚未见到有关CD-TK融合基因在膀胱癌治疗方面的报道。CD-TK融合基因的产物同时具有2种酶的活性，利用两类自杀基因疗法互补作用，可以大大提高其应用价值，而不需考虑自杀基因法疗的肿瘤细胞类型依赖性。据此我科建立了携带CD-TK融合基因的复制缺陷腺病毒载体，并设计本实验，期望能通过体内外实验明确融合基因是否较单基因存在优势，是否存在协同效应，并为发现一条治疗膀胱癌的新路做一些有意义的探索。 目的：研究复制缺陷腺病毒载体介导的CD-TK融合基因在体外能否顺利转染人膀胱癌细胞、转染后联合前体药物在体外对人膀胱癌细胞是否存在杀伤作用及旁观者效应，及其杀伤机制是否与凋亡相关，并比较融合基因与单基因对肿瘤细胞生长抑制方面有无差异，是否存在协同效应。通过体内实验研究裸鼠肿瘤形成后，通过瘤体内注射腺病毒法能否使肿瘤细胞顺利转染目的基因，转染后目的基因能否顺利表达，联合前体药物后在体内能否抑制裸鼠肿瘤生长，能否延长荷瘤裸鼠生存期，并观察治疗后肿瘤病理变化。为研究融合基因疗法能否有效治疗膀胱肿瘤提供实验依据。 方法 体外实验：利用含有CD-TK融合基因及绿色荧光蛋白(greenfluorescentproteinGFP)基因的复制缺陷腺病毒转染人膀胱癌细胞株T-24细胞，以GFP表达与否作为转染是否成功间接标志，PCR及琼脂糖凝胶电泳检测转染后细胞CD及TK基因表达情况。应用GCV和/或5-Fc作用于转染病毒前后T-24细胞，并以四甲基偶氮唑蓝(methylthiazolyltetrazoliumMTT)法检测治疗后不同时间T-24细胞的存活率(实验组OD/对照组OD)％。按比例混合转染后T-24细胞及未转染T-24细胞，同法给予前体药物，MTT法检测旁观者效应。并利用HE染色及Hoechst-PI双染试剂盒检测其细胞杀伤机理是否与凋亡相关。 体内实验：T-24细胞悬液注射入裸鼠颈部皮下，待成瘤后取肿瘤细胞进行原代培养。细胞稳定传代后建立裸鼠皮下肿瘤动物模型并将荷瘤鼠分为GCV+5-FC治疗组(GCV+5-FC组)、病毒对照组(ControlV组)和空白对照组(ControlO组)。GCV+5-FC组及ControlV组瘤体内注射腺病毒，4天后RT-PCR及琼脂糖凝胶电泳检测目的基因表达情况。GCV+5-Fc组给予前体药物(GCV+5-FC)，ControlV组予生理盐水，ControlO组给予前体药物(GCV+5-FC)腹腔注射，观察实验组与对照组肿瘤体积变化及生存期差异。治疗结束后5天各组随即挑选裸鼠一只取肿瘤组织进行HE染色及TUNEL凋亡检测，观察其病理变化。 结果：腺病毒在体外能高效转染T-24细胞，72小时转染效率可接近100％。GCV和/或5-FC均能有效杀伤转染后膀胱癌细胞，当给予相同浓度前体药物时，联合用药组显示出较强的肿瘤杀伤作用。0.5mg/mlGCV、0.1mg/ml5-FC和GCV+5-FC作用于转染后T-24细胞72小时细胞生存率经统计分析表明72h后只加病毒的病毒对照组(ControlV组)与不加任何处理的空白对照组(ControlO组)细胞生存率无显著差异(P=0.779)。GCV+5-FC组、5-FC组、GCV组与对照组比较均有显著差异(P=0.000)。GCV+5-FC组与5-FC、GCV组间细胞生存率亦存在显著差异(P=0.000)。细胞抑制率GCV+5-FC组较5-FC组及GCV组均高。而5-FC组与GCV组之间无显著差异(P=0.483)。旁观者效应较明显，融合基因组明显较强。生长于载玻片细胞经治疗后未见明显凋亡小体，而利用Hoechst-PI双染色法检测经前体药物作用后转染细胞，可见各组细胞均有凋亡现象出现，但联合用药组较单一用药组凋亡现象增多。而ControlV组未见明显凋亡细胞。体内实验表明：经治疗后GCV+5-FC组肿瘤体积明显缩小，用药后不同时间GCV+5-FC组、与ControlV组和ControlO组肿瘤体积比较均存在显著差异(P=0.000)。且生存期明显延长。联合用药组可观察到凋亡细胞，而对照组则几乎无凋亡细胞可观察到。 结论：CD-TK融合基因联合应用GCV和/或5-Fc在体外能有效杀伤膀胱肿瘤细胞，并存在较强的旁观者效应，其杀伤机制可能与凋亡有关。体内实验表明融合基因联合前体药物可明显抑制裸鼠肿瘤生长，并可显著延长荷瘤鼠生存期，但无法使肿瘤完全消退。本实验证实CD-TK融合基因对膀胱癌治疗有一定效果，但尚存在一定不足，需进一步改进。

目录

文摘

英文文摘

第一章前言

第二章材料和方法

第三章实验结果

第四章讨论

第五章小结

第六章参考文献

附录 中英文缩略语对照表

攻读学位期间成果

致谢

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