硫氧还蛋白结合蛋白2/维生素D上调蛋白1（VDUP1）在哮喘患者外周血嗜酸细胞的表达和功能研究

摘要

研究背景 支气管哮喘是常见的慢性疾病，研究哮喘的分子病理机制是有效控制哮喘的前提。针对哮喘的遗传学基础、与环境因素的关系、免疫机制等研究证实哮喘是受遗传和环境因素影响的复杂的多基因疾病。同时也发现很多尚不明了和有争议的问题，其中关于嗜酸性粒细胞(EOS)的作用是最大的争论焦点之一。 EOS是参与哮喘病理过程的炎症细胞之一。目前已经证明哮喘中EOS作用过程如下：抗原递呈细胞将抗原递呈到细胞表面，导致Th2细胞分化并产生Th2细胞因子，其中IL-5、IL-13、GM-CSF促进骨髓CD34+干细胞向EOS方向分化，在IL-5诱导下，细胞从骨髓向血管迁移；IL-4、IL-13诱导血管细胞粘附分子(VCAM-1)表达，结合到其在EOS表面受体(VLA-4)，使得血管内EOS利于穿过血管壁，到达Th2细胞介导的炎症反应部位；活化的EOS作用于气道壁多种细胞，或者分泌Th2细胞因子，导致气道粘膜以EOS浸润为特征的炎症、粘液分泌增加、气道高反应性、基底膜胶原沉积等哮喘病理生理过程。 而哮喘中EOS在活化、发挥炎症效应过程中细胞内部信号转导调节、分子调控机制以及这些细胞内部分子调控与细胞活化、发挥其在哮喘中病理作用的关系有待进一步探讨。我们实验室从哮喘发作过程中EOS基因差异表达入手，希望发现哮喘发作过程中EOS某些有意义的表达变化的基因，以及这些基因表达变化可能调控哪些EOS功能。因此，在早期研究中，应用抑制消减杂交技术，构建哮喘外周血EOScDNA消减文库，并从中筛选出56个差异表达基因，包括维生素D3上调蛋白-1/硫氧还蛋白结合蛋白2(VDUP1)。 氧化应激参与哮喘病理过程，哮喘中活化的炎症细胞和免疫细胞产生活性氧自由基(ROS)增加，TRX作为强力抗氧化剂参与哮喘病理过程：已经证明，给予卵清蛋白致敏的哮喘发作小鼠TRX，能够减轻气道高反应性(AHR)以及气道炎症；急性加重哮喘病人血清TRX水平显著增高，并与肺功能损伤程度呈正相关性；TRX作为包括肺损伤、哮喘等疾病治疗靶点已经被广泛研究；维生素D3上调蛋白1(VDUP1)/TRX结合蛋白是TRX内源性抑制因子：过度表达VDUP1抑制TRX蛋白表达和其还原活性。研究发现VDUP1通过与TRX相互作用调节细胞氧化还原状态而在糖尿病、动脉粥样硬化、心肌细胞肥大等疾病过程表现出重要作用。同样氧化应激及过多产生的ROS诱导EOS凋亡；但是，哮喘发病中，EOS存活延长、活性增强，EOS内部必然存在氧化—抗氧化调节机制，作为参与氧化应激调节的TRX-VDUP1在哮喘EOS内的表达变化以及可能存在的调节作用尚不明确；TRX-VDUP1除具有氧化调节作用外，在细胞内具有对NF-κB等转录因子调控作用，故TRX-VDUP1表达变化是否调通过控EOS内部转录因子，与EOS活化相关，同样是不明确的。 所以，在前期研究筛选出的众多差异表达基因中，选择VDUP1做进一步研究，目的是探讨哮喘发病中EOS内存在VDUP1表达变化，以及这一表达变化导致细胞活性或存活能力的改变，发现哮喘发作中EOS新的调节机制，再次证实氧化应激在哮喘病理中的重要作用以及控制氧化应激是治疗哮喘等疾病新的靶点。 方法 1、以正常自愿者20人、轻到中度急性发作未经任何治疗哮喘病人20人、轻到中度哮喘经吸入糖皮质激素等控制病情稳定病人25人为研究对象。 2、应用Percoll不连续密度梯度法分离正常人及哮喘患者外周血EOS，裂解细胞，Trizol提取总RNA，RT-PCR方法在基因水平验证VDUP1差异表达。 3、裂解细胞EOS，提取蛋白质，应用WesternBlotting方法在蛋白质水平验证哮喘外周血EOSVDUP1差异表达。 3、Percoll不连续密度梯度法分离一例正常人外周血EOS，将细胞等分4组，1组细胞立即裂解提取总RNA；3组细胞分别给予哮喘EOS相关细胞因子IL-5、IL-5加TRX氧化剂(Diamide)、IL-5加TRX烷化剂(Chloro-2,4-dinitrobenzene)孵育刺激18小时，裂解细胞，提取总RNA；RT-PCR方法半定量表达VDUP1；测定正常血清及各组细胞孵育液中EOS阳离子蛋白(ECP)浓度。比较各组VDUP1表达变化，以及ECP浓度变化。初步探讨VDUP1-TRX相互作用在EOS中的调控机制。 4、所有原始数据采用SPSS10.0软件的OneWayANOVA和BivariateCorrelations进行统计学分析。 结果 1、RT-PCR同时扩增哮喘急性发作病人、哮喘缓解期病人及正常人外周血嗜酸细胞β-Actin和VDUP1，软件分析获得VDUP1/β-Actin比值，三组分别为0.2350±0.0854(n=20)、0.7395±0.1319(n=25)、0.7497±0.0973(n=20)，统计学分析，哮喘急性发作患者外周血EOSVDUP1基因表达显著低于正常人(P＜0.001)，而哮喘缓解病人与正常人之间无显著差异(P＜0.755)。 2、WesternBlotting方法定量测定哮喘急性发作病人、哮喘缓解病人及正常人外周血EOS提取蛋白中VDUP1和β-Actin蛋白量，化学发光显影后的图像用Dolphin图象分析图像分析仪扫描，Gelpro软件检测分析求VDUP1/β-Actin比值三组分别为0.2747±0.0954(n=20)、0.3830±0.0862(n=25)、0.3683±0.1158(n=20)，统计学分析，哮喘急性发作患者EOSVDUP1蛋白水平表达显著低于正常人(P＜0.001)，而哮喘缓解病人与正常人之间无显著差异(P＜0.623)。 3、哮喘急性发作病人外周血EOSVDUP1表达与病人诱导痰EOS计数(0.4737±0.0900/mm2)呈负相关性(r=-0.946，p=0.001，t=-12.3822)。 4、急性分离正常人外周血EOSVDUP1/β-Actin为0.5110，血清ECP0.4820ug/L，等量EOS经IL-5刺激孵育后VDUP1/β-Actin为0.3740，孵育上清液ECP量1.3150ug/L；经IL-5和Diamide(TRX氧化剂)同时孵育刺激EOSVDUP1/β-Actin为0.3310，孵育上清液ECP0.5850ug/L；同样经IL-5和Chloro-2,4-dinitrobenzene(TRX烷化剂)共同孵育刺激EOSVDUP1/β-Actin为0.4120，孵育上清液ECP0.6170ug/L。3组经孵育后EOS与正常细胞比较，VDUP1表达下调；与血清ECP浓度对比，IL-5孵育组细胞孵育液中ECP浓度增高；孵育液中加入TRX还原剂和烷化剂后，孵育液ECP浓度增高不显著。 结论 1、证实哮喘EOS内VDUP1存在表达变化：急性发作未经治疗控制患者外周血EOS内VDUP1表达较正常人显著下调，而经治疗控制稳定哮喘患者外周血EOS内VDUP1表达与正常人无显著差异。同时发现哮喘急性发作未经治疗控制患者外周血EOS内VDUP1表达与痰EOS计数呈负相关性。证明哮喘EOSVDUP1表达变化与EOS引起的气道炎症反应程度以及急性期哮喘有重要相关性，当外周血EOS内VDUP1表达下调时，促进EOS动员、活化并在炎症部位浸润，加重哮喘病情。 2、发现哮喘中与EOS活化、增殖相关的细胞因子IL-5能够诱导EOSVDUP1下调表达，同时使EOS分泌嗜酸细胞阳离子蛋白(ECP)增加。直接证明VDUP1参与哮喘病理过程中EOS活性和功能的调控。 3、发现在EOS中TRX是VDUP1作用的下游因子，VDUP1对EOS活性的调控是以TRX的内源性负调节因子的方式、通过VDUP1-TRX相互作用完成的：TRX必需保持活性中心还原状态完成调节机制，当EOS内VDUP1表达变化，通过与TRX还原型活性中心相互作用，改变TRX表达和功能，调控EOS活化和功能。 4、再次证实氧化应激及细胞的抗氧化系统参与哮喘病理过程中的重要作用，机体最主要的抗氧化系统TRX-VDUP1参与哮喘EOS活性和功能的调控。哮喘病理中各种应激状态下，EOS内抗氧化系统发挥对自身的保护作用，延迟细胞存活能力，并通过内部分子调节及信号转导途径活化EOS功能。

目录

文摘

英文文摘

前言

第一章外周血EOS分离、总RNA和蛋白质提取

第二章正常自愿者与哮喘患者外周血EOS VDUP1表达

第三章VDUP1表达变化对哮喘EOS功能调控研究

结论

参考文献

中英文缩略对照表

硫氧环蛋白依赖的细胞信号转导

研究生期间主要成果

致谢