严重烧伤引起心功能障碍的心电紊乱和钙信号异常机制

摘要

本文应用膜片钳和激光共聚焦显微成像技术对严重烧伤性休克大鼠心室肌细胞电生理活动以及钙信号的变化及其机制进行研究。 第一部分严重烧伤引起心肌细胞动作电位时程延长 严重烧伤引起QT间期离散，它具有潜在引发心律失常的威胁。同时在单个心肌细胞由于动作电位时程(action potential duration，APD)的延长影响Ca<'2+>内流，从而改变兴奋．收缩偶联时钙稳态进而影响心脏的舒缩功能，但其机制尚不十分清楚。本研究复制大鼠～40％体表面积(total body surface area，TBSA)Ⅲ度烧伤模型，烧伤后按照4 ml/kg/1％TBSA腹腔补液。在伤后12 h大鼠心功能明显减弱时分离其心肌细胞，采用膜片钳技术直接研究心肌细胞APD以及AP复极化相关的重要离子通道，包括瞬间外向钾电流(transient outward current，I<,to>)，L-型钙电流(L-type Ca<'2+> current，I<,ca-L>)和内向整流钾电流(inward rectitier K<'+>current，I<,K1>)的改变。 结果发现： 1．1 严重烧伤引起动作电位时程延长烧伤后12 h单个心肌细胞APD明显延长，APD<,50>和APD<,90>在烧伤组分别为21.16±1.59 ms，108.52±10.39 ms(n=22)，明显长于对照组的7.58±0.48 ms，55.78±3.09 ms(n=17,P<0.000)。 1．2 严重烧伤引起I<,to>电流密度降低把细胞钳制在-80 mV，给予细胞250 ms、从-50 mV开始以10 mV递增到+60mV的电压刺激。烧伤组I<,to>电流密度在-30～+60 mV的电压范围内均明显低于对照组。在+60mV电压下烧伤组的电流密度(20.39+1.98 pA/pF，n=12)明显低于对照组(34.02±3.77 pA/pF，n=19，P<0.01)； 1．3 严重烧伤下调I<,K1>功能把细胞钳制于-80 mV，给予500 ms，从0 mV至-120 mV，以10 mV递减的电压刺激，测定每一电压刺激下稳定状态电流为I<,K1>电流。烧伤组的I<,K1>在-120至-90 mV电压刺激下所产生的内向电流显著低于对照组。 1．4 严重烧伤不改变I<,L-Ca>流大小细胞钳制在-40 mV，给予300 ms，从-30 mV开始以10 mV递增至+60 mV的刺激，记录不同电压下的内向电流，结果发现I<,Ca-L>在两组之间无明显差异。 结论：严重烧伤引起I<,to>和I<,K1>功能下降调节，是导致大鼠心肌细胞动作电位时程的延长的重要原因。 第二部分严重烧伤引起心肌细胞钙信号异常 烧伤引起心功能障碍是临床和实验观察证明的事实，但引起心功能障碍的细胞和分子机制并不完全清楚。以往研究表明，烧伤引起心功能障碍与细胞内钙信号紊乱有关。 本实验复制大鼠40％体表面积烧伤模型，烧伤12h心功能明显下降时急性分离心肌细胞，结合膜片钳和共聚焦显微成像技术对细胞内钙信号进行研究，发现： 2．1严重烧伤引起心肌收缩力、钙瞬变水平下降 用场刺激(10V、1Hz)引起心肌细胞收缩。烧伤心肌细胞平均最大收缩幅度明显下降，由对照组的10.51±0.39％(n=123)下降到烧伤组的5.75±0.18％(n=159，P<0.000)。动作电位(AP)引起的钙瞬变水平也呈现明显的下降，钙瞬变的峰值(△F/F<,0>)从对照组的4.01±0.08(n=123)下降到烧伤组的3.04±0.07(n=159，P<0.00)。这和平均收缩幅度明显下降具有一致性。 2．2严重烧伤降低兴奋收缩偶联效率 多种因素决定AP-钙瞬变，包括触发信号L型钙电流和SR释放。因此我们同时记录细胞膜去极化引起的钙电流和钙瞬变，并分析兴奋-收缩偶联效率以确定引起收缩期钙瞬变的原因。结果表明，在-20 mV到+40 mV电压之间钙瞬变的峰值在烧伤组明显下降，而钙电流密度没有发生明显变化。烧伤组心肌细胞兴奋一收缩偶联效率在-20 mv到+40 mV电压范围内显著降低。结果表明，SR钙释放而非钙电流的改变导致了烧伤时AP-钙瞬变的降低 2．3严重烧伤引起肌浆网钙部份耗竭 肌浆网内钙容量的大小很大程度上决定了细胞内钙释放的水平，因此我们进一步探察烧伤对心肌细胞钙库容量的影响。高浓度Caffeine使雷诺丁受体(Ryanodines，RyRs)处于完全开放状态，致使SR内钙完全排空，因此caffeine引起的钙瞬态反映了SR钙库水平。结果显示，caffeine引起的钙瞬变峰值由对照组的4.71±0.09(n=153)下降到了烧伤组的3.67±0.07(n=256)，P<0.000。提示在烧伤大鼠的心肌细胞中，兴奋-收缩偶联过程中的CICR(calcium induced calciumrelease)的功能下调主要是由于肌浆网中钙容量的部份耗竭所致。 2．4严重烧伤引起RyRs反应性增强 钙火花是内质网(肌浆网)上单个钙释放单元中几个钙释放通道RyRs的随机性开放。钙火花的发现使我们能够在完整细胞研究RyRs的功能。因此，我们对来自132个对照组的细胞中的299个钙火花以及来自168个烧伤心肌细胞中的926个钙火花作了分析和比较，发现在烧伤组的心肌细胞中，钙火花的发放频率明显高于对照组，而且钙火花的峰值(F/F<,0>)有所下降。发放频率由对照组的1.05±0.06/100 μm.s升高到2.49±0.14/100μms，P<0.000发放频率大约为对照组的将近3倍之多。而钙火花的峰值则由2.32±0.03降低到烧伤组的2.09±0.09，P<0.000。但是钙火花的上升速度及下降速度则没有明显的变化。结果表明烧伤使RyRs的反应性异常升高。 2．5严重烧伤引起细胞内钙稳定性下降 我们把进一步测定了高钙(10 mM)灌流液刺激对RyRs的功能的影响。结果显示，在烧伤组的细胞中，钙波更容易被激发，烧伤组的发生频率为1.17±0.07/100μms(n=131)，而对照组的钙波发生频率只有0.40±0.03/100μms，n=109，P<0.000)。而且，烧伤组的发生的钙波很多时候出现断裂、扭曲的现象，连续性相对较差，传播的速度和距离都有所下降，不能够很好地完成钙信号的传播。同时在同一位点观察到重复发放钙波，提示RyRs功能已受到了严重的损伤。2．6抗氧化治疗保护烧伤引起的心功能及纠正钙紊乱Vitamin C和Vitamin E联合抗氧化治疗使烧伤大鼠心肌细胞钙火花发放趋于正常。烧伤+抗氧化治疗组大鼠心肌细胞的钙火花幅度(F/F<,0>)为2.44±0.03，n=422，显著高于烧伤组(2.09±0.01，n=926)，P<0.000。尤为重要的是，抗氧化治疗使烧伤引起的钙火花发放频率增加的幅度显著降低。由治疗前的2.49±0.14/100μm.s下降到治疗后1.21±0.06/100 μm.s，P<0.000。 随着钙火花活动的恢复，抗氧化治疗使SR钙库容量得以恢复。烧伤+抗氧化治疗组，20 mm caffeine诱导的钙瞬变的幅度是5.40±0.14(n=47)，与抗氧化治疗组(5.45±0.21，n=34)无明显的差别，但明显高于烧伤组(3.67±0.07,n=256)。AP-钙瞬变与SR钙库的改变呈一致性改变，即抗氧化治疗使AP-钙瞬变有所恢复。尽管烧伤+抗氧化治疗组心肌细胞的钙瞬变△F/F0(4.96±0.15，n=68)与抗氧化治疗组(5.36±0.17，n=62)相比，有轻微下降，但仍明显高于烧伤组(3.04±0.06m,n=159,P<0.01)。 随着细胞内钙紊乱的纠正，烧伤大鼠心功能得到明显改善，表现为烧伤12h后心功能指标INSP、+dP/dtmax和-dP/dtmax由烧伤组的56.09±7.07 mmHg，+1338±340 mmHg/sec，-1036±173 mmHg/sec，上升到治疗组的95.7±9.1 mmHg，+3543+383mmHg/sec，-3543±296 mmHg/sec，(P<0.01)。 结论： 1．烧伤引起大鼠的心肌细胞AP-钙瞬态幅度(△F/F<,0>)减小，它是引起心肌细胞收缩力下降的重要原因。 2．烧伤时E-C效率明显下降引起细胞内钙释放减少，是烧伤所致心肌细胞钙瞬变大幅下降的重要机制。3．烧伤引起心肌细胞SR钙库容量发生部分耗竭，导致了E-C效率的降低。 4．烧伤后心肌细胞RyR活动增加(钙火花发放增加)，SR钙漏流增强，是SR钙库容量部分耗竭，胞浆钙蓄积的重要原因，它是烧伤心功能障碍发生的一个重要环节。 5．引起RyR反应性升高的重要机制是烧伤引起的氧化应激增强，抗氧化治疗的心脏保护作用可以为临床重度烧伤病人提供一种治疗方案。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词

声明

第一部分 严重烧伤延长大鼠心室肌细胞动作电位时程及其机制

前言

实验材料与方法

实验结果

讨论

第二部分 严重烧伤引起心肌钙信号异常

前言

实验材料与方法

实验结果

讨论

结论

工作展望

参考文献

硕士期间发表及待发表文章

致谢