极端耐辐射异常球菌Deinococcus radiodurans错配修复基因的功能鉴定和分析

摘要

本研究利用sacB/Sucs和rpoB/RifR突变分析系统，对预测的与错配修复相关的极端耐辐射异常球菌mutS基因(mutS1和mutS2)进行了基因功能分析和鉴定。 研究利用Bacillussubtilis的sacB基因引入到D.radiodurans细胞，成功地建立了一种研究突变频率和突变图谱的sacB/蔗糖敏感(sacB/Sucs)突变分析系统。并首次应用到极端耐辐射异常球菌D.radiodurans中，分析了该生物的突变作用以及探讨了mutS1和mutS2基因功能。借用条件致死基因sacB作为阳性选择标记，捕获了四种D.radiodurans中可移动插入序列(IS)元件：IS8031、IS2621、ISdrTCL2和ISdrTCL1。发现IS元件是细胞自发突变、诱发突变和导致基因失活的主要原因。对构建的D.radioduransmutS1(DR1039)、mutS2(DR1976)及DR1975基因缺失突变株的突变频率以及突变图谱的分析表明，这些基因的缺失提高了D.radiodurans的自发突变和辐射诱发突变频率2-10倍，其中mutS2基因的缺失导致8kGy的γ辐射诱发突变频率提高了近10倍，研究结果表明mutS1(DR1039)、mutS2(DR1976)及DR1975基因能有效地抑制IS元件的转座活性，在维护D.radiodurans基因组的稳定性起到重要作用。 为确定D.radiodurans这些基因在DNA错配修复途径中的作用。利用来自分析Escherichiacoli碱基替换的突变分析系统——rpoB/RifR突变分析系统，测定和分析了自发突变导致D.radioduransrpoB基因RifR的突变频率和突变图谱。研究结果表明D.radioduransmutS2基因不影响碱基替换(点突变)和9bp缺失引起的自发突变频率，而mutS1和DR1975基因的缺失提高了rpoB基因RifR突变频率2倍和8倍。突变图谱分析表明mutS1基因的缺失导致突变热点由野生型的一个热点1259(T→G)改变为三个(1435(G→A)、1319(C→A)和1441(A→C))；而DR1975基因的缺失增加另一个热点1441(A→C)。用含有碱基替换和9bp的RifRrpoB基因片段进行的转化试验表明mutS1基因的缺失提高了碱基替换rpoB基因片段转化效率，高于转化野生型菌株的3.5倍，转化mutS2和DR1975基因缺失菌与野生型菌株的效率没有区别，用9bp缺失突变的rpoB基因片段对所有测试菌株的转化频率没有差异。研究结果证实mutS2基因编码的MutS2不参与DNA碱基错配修复途径；mutS1基因编码的MutS1蛋白为错配修复途径的关键酶。目前有关D.radiodurans错配修复的研究甚少，本研究结果为探求D.radiodurans错配修复的分子机制奠定理论基础。

目录

文摘

英文文摘

独创性声明及关于论文使用授权的声明

第一章文献综述

第二章耐辐射异常球菌sacB/SucS突变系统的建立

第三章sacB基因突变图谱的分析

第四章 错配修复基因mutS1功能分析

第五章结论

参考文献

致 谢

附录

个人简历