耐辐射异常球菌冷激蛋白的功能鉴定及转录组分析

摘要

冷激蛋白(cold shock protein,Csp)通常在冷环境下大量合成,普遍存在于动物、植物和真细菌中。这类蛋白含有结合RNA和ssDNA的特异冷激结构域,具有RNA分子伴侣或转录增强子的功能,在生物冷胁迫适应反应中起着重要的调节作用。耐辐射异常球菌(Deinococcusradiodurans)R1含有1个csp-like基因,其突变导致细胞对电离辐射敏感,但该基因是否具有冷激蛋白功能尚不清楚。本论文通过基因突变、Biolog技术和转录组学分析等对csp-like基因的功能及其调节作用进行了深入研究,取得如下研究进展:
　　 csp—like基因编码一个10kDa的蛋白,包含86个氨基酸残基。序列分析发现,它与Bacillussubtilis的CspB一致性为50％,含有结合RNA和ssDNA的特异冷激结构域。实时定量PCR分析显示,csp-like基因15℃冷激2 h上调1.87倍,其表达具有冷激诱导特性。△csp突变株较野生型R1菌株在最适温度时生长缓慢,15℃低温生长停滞。研究结果表明,该基因产物是一个典型的冷激蛋白。
　　 Biolog分析发现,△csp突变株较野生型R1菌株的碳源利用水平显著改变,csp缺失造成细胞对葡萄糖等8种碳源利用显著下降,3种碳源利用提高。凝胶阻滞实验结果表明,D.radioduransCsp结合富含胸腺嘧啶的ssDNA,也结合Y-box(ATTGG)序列或其反向互补序列,结合序列分析推测,Csp可能通过结合其启动子上游Y-box反向互补序列增强自身表达。
　　 为了进一步研究csp基因对细胞代谢的调控作用,本论文开展了正常生长条件下野生型R1菌株和△csp突变株的转录组学分析。结果表明,csp突变导致466个基因表达上调,322个基因表达下调,表达差异基因产物与细胞壁／细胞膜／细胞包膜生物合成、翻译／核糖体结构和生物合成、复制重组和修复、信号转导机制、能量产生和转换、氨基酸运输和代谢、脂类运输和代谢以及次级代谢产物的合成运输和分解代谢等有关。实时定量验证了该结果。其中,类胡萝卜素合成相关基因整体表达增强,其合成关键基因crtI上调2.8倍。细胞形态观察和色素含量测定发现csp突变株培养物及菌落颜色加深,胞内及胞外类胡萝卜素含量显著增加,表明csp基因参与了细胞色素合成的调控。ddrB、ddrI、recd、pprA和irrE等DNA应答反应和损伤修复蛋白多数被诱导表达,氧化抗性蛋白基因表达下调,推测csp导致氧化抗性蛋白下降是造成突变株对UV辐射敏感的主要原因。肽聚糖合成相关基因和细胞包膜S层蛋白基因表达上调,细胞超微结构的电子显微镜观察显示,突变株细胞壁最外层物质增多呈泡状溢出甚至脱落；ABC转运子相关基因的表达显著变化,显影质谱分析显示,突变株细胞多肽或脂多肽类物质分布改变,表明csp影响了细胞包膜的正常形态建成和物质运输。
　　 本研究表明,耐辐射异常球菌冷激蛋白Csp通过直接或间接的调控作用,影响了细胞的多种生理胁迫反应,包括细胞的抗氧化保护、DNA损伤修复及色素合成等过程,为进一步揭示耐辐射异常球菌极端环境的适应机制奠定了理论基础。