产紫杉醇菌株原生质体诱变育种及其生物合成调控的研究

摘要

肿瘤和癌症是目前严重威胁人类生命的顽症之一.对于人类来说,这是仅次于心脑血管疾病的第二大死因.长期以来,世界各国的许多学者对于各种癌症的防治进行了种种尝试与探索,但结果都不甚令人满意.目前,紫杉醇己被国内外一致公认为是一类对多种癌症具有显效乃至特效的抗癌新药.因此,采取各种途径生产紫杉醇已经成为国内外紫杉醇研究和规模开发的热点.与其它方法相比,微生物发酵法生产紫杉醇的优势是显而易见的.本试验采用单因子试验设计方法,对影响紫杉醇产生菌UV<,40-19>.合成紫杉醇的培养温度、发酵液初始pH、摇床转数进行了探讨,确定了最佳培养条件;通过单因子和正交试验设计研究了前体物、诱导子和抑制剂及其协同对紫杉醇产生菌合成紫杉醇的调控作用.同时,对紫杉醇菌株UV<,40-19>的原生质体制备、再生及紫外线和亚硝基胍复合诱变育种进行了研究筛选潮霉素抗性突变株.另外,通过同工酶技术、RAPD、AFLP和ITS序列分析对出发菌株NCEU-1与两高产株UV<,40-19>和UL<,50-6>间的遗传差异进行了研究.此外,利用Southern blotting技术对细胞培养中紫杉二烯合成酶是否也存在于通过微生物发酵法生产紫杉醇的生物合成途径中进行了初探.目前,在利用紫杉醇产生菌合成紫杉醇的研究领域内,尚未见有关本试验研究方面的报道.因此,本试验在这几方面研究取得的突破性进展,为通过微生物发酵法生产抗癌药物紫杉醇的生物合成调控和构建高产基因工程菌株提供了强有力的理论指导;为早日实现利用微生物发酵法生产抗癌药物紫杉醇的工业化生产、创造巨大经济效益和社会效益展示了美好的前景. 本试验的主要研究结果如下: 1、紫杉醇产生菌UV<,40-19>生物合成紫杉醇的最佳发酵培养条件为:S-7发酵液初始pH5.5,摇床温度25℃,摇床转速150r/min; 2、向S-7发酵培养基添加适当浓度的前体物、代谢旁路抑制剂和诱导子对微生物发酵法生产紫杉醇的合成代谢进行综合调控可以大大提高紫杉醇的产量: 3、采用试验得出的最佳发酵培养条件,以筛选出的优化培养基作为发酵培养基,菌株UV<,40-19>发酵液中紫杉醇含量为493.74μg/L,是改良S-7发酵培养基的1.25倍; 4、Nodulisporium sylviforme 紫杉醇产生菌UV<,40-19>原生质体制备及再生的最佳条件为:每 250mg 湿菌丝体加酶液1 mL(0.7mol/LNaCl配制由3﹪溶壁酶+3﹪纤维素酶+4﹪蜗牛酶+1﹪的溶菌酶组成的复合酶系,pH5.5～6.0)→0℃振荡酶解5h→酶解液用三层无菌镜头纸过滤→3000r/min离心 10min,收集原生质体;将获得的原生质体在含NaCl∶KCl∶葡萄糖(5∶3∶2,v/v/v,终浓度均为0.7mol/L)的PDA再生培养基上,采用双层平板培养法再生制备到的原生质体; 5、Nodulisporium sylviforme 紫杉醇产生菌UV<,40-19>原生质体诱变的适宜条件为:将原生质体悬液经过0.8mg/mL NTG、处理15min 后,在电磁搅拌下,用紫外灯(30w,距离3 0cm)照射处理40s; 6、在潮霉素含量为90μg/mL的抗性平皿中筛选出了一株高产紫杉醇的原生质体诱变菌株-UN<,05-3>,其产量从出发菌株紫杉醇的产量 (376.38±8.41)μg/L提高至(478.12±11.36)μg/L; 7、探索出了一种新的、快速而高效的树状多节孢紫杉醇产生菌基因组DNA的提取方法; 8、通过同工酶技术、RAPD、AFLP和ITS序列分析表明,出发菌株与诱变菌株之间以及两诱变菌株之间都存在明显差异,为进一步研究与紫杉醇生物合成相关基因及诱变株产量提高的分子机制奠定了基础; 9、从东北红豆杉 (Taxus cuspidata) 树叶中获得了紫杉二烯合成酶基因片段克隆,用GenBank(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)中的Blast程序对此个序列与GenBank中收录的序列进行了同源性比较,同源性达到98﹪; 10、首次证实了紫杉二烯合成酶基因也存在于紫杉醇产生菌--树状多节孢Nodulisporium sylviforme这类丝状半知菌中,这预示紫杉二烯合成酶也存在于通过微生物发酵法生产紫杉醇的生物合成途径中.

目录

文摘

英文文摘

1引言

1.1课题研究背景、立题依据及研究意义

1.2文献综述

1.2.1紫杉醇概述

1.2.2生物技术生产紫杉醇的研究现状

1.2.3原生质体诱变技术

1.2.4紫杉醇的生物合成途径及其代谢调控

1.3本论文的主要研究内容

2紫杉醇产生菌产紫杉醇发酵培养条件的优化

2.1材料与方法

2.1.1材料

2.1.2试验方法

2.2结果与讨论

2.2.1发酵条件单因素试验

2.2.2生物量测定

2.2.3不同培养时期紫杉醇产量的测定

3代谢调节剂间的协同作用对紫杉醇产生菌紫杉醇产量影响的研究

3.1前体物间协同作用对紫杉醇产生菌生物合成紫杉醇影响的研究

3.1.1材料与方法

3.1.2试验方法

3.1.3结果与讨论

3.2添加诱导子对紫杉醇生物合成的影响

3.2.1材料与方法

3.2.2试验方法

3.2.3结果与讨论

3.3前体物和诱导子间的协同对紫杉醇产生菌生物合成紫杉醇影响的研究

3.3.1材料与方法

3.3.2试验方法

3.2.3结果与讨论

3.4前体物、抑制剂及诱导子的协同作用对紫杉醇生物合成影响的研究

3.4.1试验材料

3.4.2试验方法

3.4.3结果与讨论

4紫杉醇产生菌原生质体诱变选育高产紫杉醇突变株的研究

4.1材料

4.1.1菌株

4.1.2培养基

4.1.3主要试剂

4.1.4试验仪器及设备

4.2方法

4.2.1菌丝体的培养和收集

4.2.2原生质体制备

4.2.3原生质体活性检测与再生

4.2.4潮霉素最小抑制浓度的筛选

4.2.5原生质体诱变

4.2.6突变株的抗性筛选

4.2.7遗传稳定性的测定

4.2.8紫杉醇提取方法

4.2.9紫杉醇定性及半定量方法

4.2.10柱层析纯化

4.2.11紫杉醇定量方法

4.3结果与讨论

4.3.1原生质体制备

4.3.2原生质体再生

4.3.3原生质体诱变育种

5紫杉醇高产菌株间遗传变异初探

5.1材料

5.1.1菌株

5.1.2培养基

5.1.3主要分子生物学与生化试剂

5.1.4溶液和溶液的配制

5.1.5染色液和染色液的配制

5.1.6试验仪器及设备

5.2方法

5.2.1菌丝体培养和收集

5.2.2紫杉醇产生菌基因组DNA的提取及鉴定

5.2.3同工酶的提取

5.2.4 RAPD扩增

5.2.5 AFLP扩增

5.2.6紫杉醇产生菌rDNA ITS区的克隆与序列分析

5.3结果与分析

5.3.1紫杉醇产生菌基因组DNA的提取

5.3.2同工酶分析

5.3.4 RAPD分析

5.3.5 AFLP分析

5.3.6 ITS序列分析

6紫杉醇生物合成代谢途径中紫杉烯合成酶基因的克隆

6.1试验材料

6.1.1菌种和质粒

6.1.2培养基

6.1.3主要分子生物学及生化试剂

6.1.4试验仪器及设备

6.2试验方法

6.2.1东北红豆杉(Taxus cuspidata)细胞总RNA的提取及鉴定

6.2.2总RNA中DNA污染的去除

6.2.3引物的设计与合成

6.2.4反转录与聚合酶链式反应(RT-PCR)

6.2.5 PCR扩增RT-PCR产物

6.2.6纯化PCR产物

6.2.7回收的PCR扩增产物与载体的连接反应

6.2.8 E.coli JM109感受态细胞的制备

6.2.9连接产物转化E.coli JM109感受态细胞

6.2.10大肠杆菌中质粒DNA的制备

6.2.11重组质粒的筛选与鉴定

6.2.12测序

6.2.13序列的同源性比较

6.3结果与分析

6.3.1提取东北红豆杉(Taxus cuspidata)细胞总RNA

6.3.2引物设计

6.3.3反转录与聚合酶链式反应(RT-PCR)

6.3.5 PCR扩增产物与载体的连接及转化

6.3.6克隆的筛选与鉴定

7紫杉烯合成酶基因和紫杉醇产生菌HQD33基因组DNA的Southern blotting

7.1试验材料

7.1.1菌种

7.1.2培养基

7.1.3主要分子生物学及生化试剂

7.1.4试验仪器、用品及器具

7.1.5试剂的配制

7.2试验方法

7.2.1紫杉醇产生菌HQD33基因组DNA的提取及鉴定

7.2.2 Southern转移

7.2.3 DNA探针的制备

7.2.4 DNA分子杂交(DNA hybridization)

7.2.5杂交后洗膜

7.2.6放射自显影

7.3结果与分析

7.3.1质粒及紫杉醇产生菌HQD33基因组DNA酶切

7.3.2紫杉醇产生菌HQD33基因组DNA的Southern blotting

8结论

参考文献(REFERENCES)

致谢(Acknowledgements)

博士生期间发表的学术论文和专著

博士后期间发表的学术论文和专著

个人基本情况