小麦耐盐相关基因HKT克隆及多样性与功能研究

摘要

本文根据小麦TaHKT1(high-affinitypotassiumuptaketransporter)cDNA核苷酸序列设计引物，从普通小麦中国春中分别克隆出TaHKT1的基因组序列和cDNA序列，通过二者的比较，确定了TaHKT1的基因结构。TaHKT1含有3个外显子和2个内含子。在38份普通小麦材料中发现5种类型TaHKT1，分别命名为TaHKT1-1、TaHKT1-2、TaHKT1-3、TaHKT1-4和TaHKT1-5。根据TaHKT1基因组序列，从不同小麦材料中分别克隆了TaHKT1-1、TaHKT1-2、TaHKT1-3和TaHKT1-4相应的cDNA序列，但未发现TaHKT1-5相应的cDNA，并且根据结构预测TaHKT1-5在N195存在1个终止密码子，因此推测TaHKT1-5可能为假基因。在小麦野生近缘种中克隆了19种TaHKT1，其核苷酸序列多样性高于普通小麦。小麦野生近缘种、地方品种和育成品种TaHKT1多样性分析表明，TaHKT1属于驯化基因。 根据小麦TaHKT1cDNA序列设计引物筛选粗山羊草(Aegi1opstauschii)AL8/78BAC文库和矮败中国春小麦BAC文库，通过单克隆BAC质粒延伸测序克隆了TaHKT2、TaHKT3以及TaHKT1、TaHKT2和TaHKT3的侧翼序列。在13份普通小麦材料中分别克隆了2种类型TaHKT2和3种类型TaHKT3，分别命名为TaHKT2-1、TaHKT2-2、TaHKT3-1、TaHKT3-2和TaHKT3-3。TaHKT25，-非翻译区2个碱基的缺失可能是导致该基因沉默的原因。在普通小麦莱州953中克隆了TaHKT4及其侧翼序列，在13份普通小麦材料中克隆了5种类型TaHKT4，分别命名为TaHKT4-1、TaHKT4-2、TaHKT4-3、TaHKT4-4和TaHKT4-5。根据TaHKT2、TaHKT3和TaHKT45’侧翼序列设计基因特异引物，以中国春缺四体DNA为模板，将TaHKT2、TaHKT3和TaHKT4分别定位于染色体7D、7B和7A。 根据水稻SKC1(ShootK+Content)对应的小麦EST序列设计引物，筛选粗山羊草AL8/78BAC文库，测序获得粗山羊草AL8/78AeSKC1，进一步克隆了普通小麦中国春TaSKC1。在27份普通小麦材料中仅发现TaSKC1-1和TaSKC1-22种类型TaSKC1，二者仅在第一内含子存在1个碱基的转换。在14份地方品种和13份育成品种中发现均仅含有TaSKC1-1和TaSKC1-2。从8份小麦合成双二倍体(染色体组为ABD)中克隆了5种TaSKC1，其中3种与普通小麦TaSKC1不同。小麦合成双二倍体、地方品种和育成品种TaSKC1的多态性研究表明，TaSKC1在驯化过程中存在明显的瓶颈效应，属于驯化基因。根据小麦TaSKC1设计引物筛选矮败中国春小麦BAC文库，获得小麦TaSKC2及其侧翼序列，在12份普通小麦材料中发现2种类型TaSKC2，分别命名为TaSKC2-1和TaSKC2-2。在地方品种茶淀红、小白麦和古城营分别发现6种、6种和8种TaSKC2。TaSKC2相应的cDNA未被发现，因此TaSKC2可能为沉默基因。 构建了TaHKT1(TaHKT1-1、TaHKT1-2和TaHKT1-3)、TaHKT3-2、TaHKT4-2以及TaSKC1酵母表达载体，通过LiAc/SSCarrierDNA/PEG法分别转入酵母盐敏感突变菌株G19。小麦HKT基因家族成员Na+吸收能力由低到高的顺序为TaHKT4-2＜TaHKT3-2、TaHKT1-3＜TaHKT1-1＜TaHKT1-2、TaSKC1。酵母生长抑制试验表明：小麦材料中不同TaHKT1、同一小麦材料中不同TaHKT和TaHKT基因家族不同成员的Na+吸收性质存在着差异。 以含有TaHKT1的BAC质粒为模板进行PCR扩增，分别得到含有TaHKT1启动子序列574bp、1224bp和1828bp片段的PCR产物。利用SalⅠ和EcoRⅠ双酶切构建了启动子表达载体1391Z-574、1391Z-1224和1391Z-1828。渗透法转化拟南芥，潮霉素筛选获得抗性苗，通过基因组DNAPCR扩增鉴定得到转基因拟南芥。TaHKT1启动子3个片段在拟南芥幼苗中表达谱基本一致，但随着片段长度的延长，表达强度降低。GUS组织化学分析结果表明，最小启动子片段(-47bp--620bp)包含决定TaHKT1特异表达的元件，而其上游(-621--1874bp)可能存在一些负调控元件，从而减弱了TaHKT1的表达强度。

目录

文摘

英文文摘

独创性声明及关于论文使用授权的声明

第一章绪论

第二章普通小麦HKT基因克隆

2.1材料与方法

2.2结果与分析

2.3讨论

第三章普通小麦HKT基因多样性研究

第四章普通小麦HKT功能研究

第五章普通小麦HKT1启动子功能研究

第六章全文结论

参考文献

致谢

作者简历