牛梨形虫核糖体RNA转录间隔区序列的测定及应用

摘要

牛梨形虫病(旧称焦虫病)是由顶复门、梨形虫纲、梨形虫目中的巴贝斯科(Babesiidae)巴贝斯属(Babesia)和泰勒科(Theileriidae)泰勒属(Theileria)的多种原虫寄生于牛的红细胞或网状内皮细胞内所引起的一类疾病的统称,以高热、贫血、黄疸、血红蛋白尿或体表淋巴结肿大为主要特征,严重时可引起动物死亡.本病在我国分布广、危害严重,常常给疫区的养牛业造成巨大损失. 本研究用实验室内分离保藏的牛梨形虫病病原,包括:5种牛巴贝斯虫(9株)和3种泰勒虫(7株),感染实验动物,采集染虫血液,提取基因组DNA,设计适当引物,利用PCR方法扩增核糖体RNA基因转录间隔区(ITSl-5.8S-ITS2),将扩增产物连接到pGEM-Teasy载体,进行核苷酸序列测定.结果显示,巴贝斯虫转录间隔区核苷酸片段的大小在577bp-750 bp之间,泰勒虫在916-1074bp.用所测得的ITSl-5.8S-ITS2、ITSl、5.8S和ITS2序列分别构建系统发生树,并进行同源性比较.结果显示:我国牛的梨形虫可明显分为泰勒虫和巴贝斯虫两枝,与传统分类方法及18S rRNA系统发生树的结果基本一致.巴贝斯虫的ITSl和ITS2核苷酸区段变异较大,种间同源性分别在4.4﹪-97.7﹪,有时甚至超过种内不同地方株之间的关系,但在ITSl-5.8S-ITS2、ITSl和ITS2序列的系统发生树上,牛巴贝斯虫、大巴贝斯虫和牛巴贝斯虫未定种新疆株均自成一枝,双芽巴贝斯虫与卵形巴贝斯虫共处一枝,位于卵形巴贝斯虫汶川株与卵形巴贝斯虫其它3个分离株之间;5.8S较保守,种间同源性在61.3﹪.100﹪之间,系统发生树上各种巴贝斯虫的分布与ITSl-5.8S-ITS2、ITSl和ITS2系统发生树基本一致.泰勒虫ITSl和ITS2区段种内变异较小,种内地方分离株之间的同源性远远大于种间同源性;环形泰勒虫3个地方株之间ITSl-5.8S-ITS2、ITSl、5.8S和ITS2序列的同源性分别为92.2﹪-94.2﹪、91.2﹪-93.1﹪、97.5﹪-98.1﹪和92.7﹪-95.3﹪,瑟氏泰勒虫3个地方株之间4个核苷酸区段的同源性分别为97.0﹪-97.9﹪、96.2﹪-97.3﹪、98-7﹪.99.4﹪和97.8﹪-99.3﹪,中华泰勒虫3个地方株之间4个核苷酸区段的同源性分别为98.3﹪-99.6﹪、98.2﹪-99.5﹪、99.4﹪-100.0﹪和97.7﹪-100.0﹪;而环形泰勒虫与瑟氏泰勒虫4个核苷酸区段之间的同源性分别为18.3﹪-35.7﹪、5.4﹪-5.6﹪、95.6﹪-98.1﹪和12.3﹪-14.8﹪,环形泰勒虫与中华泰勒虫4个核苷酸区段之间的同源性分别为18.7﹪-36.5﹪、8.9﹪-11.8﹪、94.9﹪-97.5﹪和9.1﹪-20.7﹪,瑟氏泰勒虫与中华泰勒虫4个核苷酸区段之间的同源性分别为54.2﹪-55.3﹪、29.7﹪-33.0﹪、96.2﹪-98.1﹪和61.0﹪-61.7﹪;在所建立的4个系统发生树上,环形泰勒虫、瑟氏泰勒虫和中华泰勒虫分处于3个分枝上.该结果比18SrRNA基因更清楚的揭示:我国存在三种牛的泰勒虫,它们是环形泰勒虫、瑟氏泰勒虫和中华泰勒虫,中华泰勒虫是不同于其它泰勒虫的一个有效种. 根据已测定的核糖体转录间隔区基核苷酸列设计牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫的特异性引物,建立了一种能够同时检测牛巴贝斯虫和牛双芽贝斯虫的多重PCR检测方法,且与其它梨形虫病病原没有交叉反应,对双芽巴贝斯虫和牛巴贝斯虫混合感染血样的检测敏感性分别可达到10<'-5>10<'-4>.通过对114份人工感染及治疗后所采血样的检测,PCR方法检测阳性率为50.88﹪,显微镜检测阳性率23.68﹪,显示多重PCR检测方法明显优于显微镜检测.

目录

文摘

英文文摘

独创性声明及关于论文使用授权的声明

第一章引言

1.1研究目的和意义

1.2国内外研究现状

1.2.1牛梨形虫病的主要病原

1.2.2系统发育研究

1.2.3牛巴贝斯虫病的诊断

1.3研究内容和方法

第二章牛梨形虫核糖体RNA转录间隔区序列的测定和分析比较

2.1材料和方法

2.1.1虫体

2.1.2动物

2.1.3虫体的提取与纯化

2.1.4虫体基因组DNA样品的提取

2.1.5引物的设计

2.1.6目的片断的PCR扩增

2.1.7 PCR产物的纯化回收

2.1.8目的基因的克隆

2.1.9重组质粒的提取与鉴定

2.1.9目的片段的序列测定

2.1.10序列比较和系统发育树的建立

2.2结果

2.3讨论

第三章双芽巴贝斯虫和牛巴贝斯虫多重PCR检测方法的初步建立

3.1材料和方法

3.2结果

3.3讨论

第四章全文结论

参考文献

附表 本试验室测定的牛梨形虫转录间隔区基因序列

致谢

作者简历