茶树ACS、ACO基因克隆与亲环素基因的鉴定及其表达分析

摘要

乙烯是一种重要的植物激素,参与植物整个生理过程.ACC合成酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid synthase,ACS)和ACC氧化酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylicacid oxidase.ACO)是植物乙烯合成过程中的重要酶,对乙烯的合成具有重要的调控作用,所以这两个基因的研究具有理论与实际意义. 在茶树新梢cDNA文库测序所获得的EST基础上,利用RACE(Rapid Amplification cDNAEnds)、RT-PCR等技术,克隆得到编码这两个酶的全长基因序列,在NCBI上分别登录为EF205149、DQ904328.其中ACS长1579 bp,编码478个氨基酸,预测分子量约为53.7 KD,等电点8.039:ACO长1237 bp,编码320个氨基酸残基,预测分子量为36.2 KD,等电点5.41.以Neighbor-Joining法构建进化树,发现ACS及ACO都与柿树中的同类基因同源性最高,亲缘关系最近.这两个基因的获得为以后进一步研究其在茶树抗逆中的作用打下一定的基础. 根据所得到的茶树ACS及ACO基因序列设计引物,利用β-actin作为阳性对照,取安吉白茶、6/8、杭州大叶、龙井长叶、薮北、龙井43和福鼎大白茶7个品种在经历高温和低温,以及龙井43在冬天不同时期样品逆转录的cDNA进行RT-PCR分析,结果发现ACS及ACO基因的表达量与品种的抗逆性强弱有一定程度的相关性;在不同时期龙井43样品中,ACS及ACO基因的表达也有类似的结果. 亲环素广泛存在于多种生物体内,在植物的发育和新陈代谢等生理过程中具有重要作用.通过对茶树新梢cDNA文库大量随机测序,获得了一个编码亲环素的全长基因,在GenBank登录,登录号为DQ904327.茶树亲环素基因cDNA全长949 bp,其中开放阅读框全长495 bp,编码蛋白质含有164个氨基酸,分子量约为17.47 kD,等电点约为8.54,它具备5'端非编码区的

目录

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第一章 文献综述及研究思路

1.1植物ACS与ACO基因研究概况

1.1.1 ACS和ACO基因克隆

1.1.2 ACS和ACO启动子研究

1.1.3 ACS和ACO基因表达研究

1.1.4 ACS和ACO转基因研究

1.2亲环素基因研究概况

1.3茶树中这三个基因相关研究

1.4植物基因克隆的常用方法

1.4.1简并PCR技术

1.4.2 RACE技术

1.4.3表达序列标签法

1.5基因表达的分析方法

1.6本论文的研究目的及意义

第二章 茶树ACS基因的克隆及RT-PCR分析

2.1材料

2.1.1实验材料

2.1.2常用溶液

2.2方法

2.2.1总RNA的提取

2.2.2 ACS基因中间序列的获得

2.2.3 ACS基因3’端序列的获得

2.2.4 ACS基因5’端序列的获得

2.2.5不同茶树品种、龙井43冬季不同时间ACS基因的RT-PCR分析

2.3结果与分析

2.3.1 RNA提取

2.3.2 ACS基因中间序列的扩增

2.3.3 ACS基因3’端序列的扩增

2.3.4 ACS基因5’端序列的扩增

2.3.5三段序列的拼接

2.3.6茶树ACO基因所编码的氨基酸与同源序列的联配

2.3.7进化树构建

2.3.8 ACS基因不同品种间的相对表达含量分析

2.3.9不同时期龙井43中ACS基因的表达

2.4讨论

第三章 茶树ACO基因的克隆与RT-PCR分析

3.1材料

3.2方法

3.2.1 ACO基因克隆

3.2.2不同茶树品种、龙井43冬季不同时间ACO基因的RT-PCR分析

3.3结果与分析

3.3.1 ACO基因部分EST片段序列的获得

3.3.2 ACO基因中间序列的获得

3.3.3 ACO基因全长序列的获得

3.3.4荼树ACO基因所编码的氨基酸与同源序列的联配

3.3.5进化树构建

3.3.6 ACO基因不同品种间的相对表达含量分析

3.3.7不同时期龙井43中ACO基因的表达

3.4讨论

第四章 茶树亲环素基因cDNA全长的分析鉴定与原核表达

4.1材料与试剂

4.1.1材料

4.1.2实验试剂

4.2方法

4.2.1茶树新稍EST测序及Cyclophilin基因的鉴定

4.2.2亲环素基因的序列分析、多序列联配及进化树构建

4.2.3亲环素基因的原核表达

4.3结果与分析

4.3.1亲环素基因克隆的鉴定

4.3.2亲环素蛋白的多序列联配

4.3.3亲环素基因进化分析

4.3.4亲环素基因的克隆与酶切鉴定

4.3.5亲环素基因表达载体的构建

4.3.6亲环素基因诱导表达

4.4讨论

第五章 全文结论与展望

5.1全文结论

5.2展望

参考文献

致谢

作者简历