利用噬菌体展示技术鉴定猪瘟病毒E2蛋白抗原表位

摘要

猪瘟 (classical swine,fever,CSF) 是由猪瘟病毒 (Classical swine fever virus,CSFV) 引起的一种高度接触性传染病,几乎遍及全世界(除北美洲和大洋洲外),死亡率高达80﹪～90﹪.该病被世界动物卫生组织(OIE)列入OIE疾病名录(OIE Listed diseases),为须申报的 (notifiable)动物传染病. 抗原表位,又称抗原决定簇,是抗原分子抗原性的基础.正确而详细地绘制抗原表位图谱对疾病的诊断、设计无毒副作用的多表位疫苗以及免疫治疗试剂等具有积极的意义.为深入了解CSFV的抗原结构,便于设计科学合理的疫苗和诊断试剂,我们对CSFV石门株(Shimen株)E2蛋白进行了抗原表位鉴定. 本研究首先利用噬菌体随机 12 肽库对CSFV Shimen 株 E2 蛋白单克隆抗体HQ06进行了3轮筛选,获得一致序列LFDGSNP,与E2蛋白氨基酸序列对比发现,此一致序列与E2蛋白N-端的B/C和A抗原区<'772>LFDGTNP<'778>序列具有很高的同源性.为了进一步验证此基序是否为一表位,将多肽LFDGTNP与 GST 在原核系统中融合表达,Western blot和ELISA结果显示表达LFDGTNP 的融合蛋白可以被 HQ06 特异性识别,证实<'772>LFDGTNP<'775>确为抗原表位.由以上结果表明,<'772>LFDGTNP<'778>为CSFV Shimen株的一个保守的线性B细胞抗原表位,此表位的鉴定对猪瘟病毒诊断研究具有一定的参考价值. 另外,本研究利用昆虫杆状病毒表达系统分泌表达了CSFV Shimen 和 CSFV HCLV株的E2蛋白.重组蛋白Shimen-E2 和 HCLIV-E2都是以二聚体的形式分泌表达于细胞培养液中,并且分子量存在差异.重组蛋白Shimen-E2和HCLV-E2均可被猪瘟病毒抗血清和猪瘟E2蛋白单克隆抗体HQ06所识别.定点突变分析表明,Shimen-2和HCLV-E2分子量大小差异是由于在<'986>NYT(A)处糖基化位点的不同所致.用纯化后的重组蛋白Shimen-E2作为免疫原,建立了一株特异性分泌E2单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为6E10.此细胞株分泌的单克隆抗体可以特异性识别猪瘟病毒,但与变性的E2蛋白反应很弱,初步推测单克隆抗体6E10可能是针对E2蛋白的构象表位.利用噬菌体随机12肽库对单克隆抗体进行3轮筛选,获得9个噬菌体克隆,与单克隆抗体6E10均发生特异性反应,测序结果显示,噬菌体克隆展示一致序列 YWH,但与E2蛋白无同源序列,推测这些克隆为模拟表位. 总之,本研究鉴定了猪瘟病毒一个线性B细胞表位<'772>LFDGTNP<'778>,研制了一株CSFV特异性单克隆抗体6E10的杂交瘤细胞系,并对其针对的抗原表位进行了初步的鉴定,为深入了解CSFV E2蛋白结构功能和建立猪瘟病毒诊断方法奠定了基础.

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略表

独创性声明及关于论文使用授权的声明

第一章绪论

1.1猪瘟病毒概况

1.2猪瘟病毒结构蛋白的结构和功能

1.3猪瘟病毒抗原表位的研究进展

1.4抗原表位研究方法

1.5噬菌体展示技术在抗原表位研究中的应用

1.6研究内容和方法

1.7研究目的和意义

第二章利用噬菌体展示随机肽库鉴定猪瘟病毒E2糖蛋白N-端一个线性B细胞抗原表位

2.1材料和方法

2.1.1肽库、菌株与单克隆抗体

2.1.2单抗的纯化

2.1.3噬菌体展示肽库的生物淘选

2.1.4噬菌体夹心ELISA

2.1.5测序DNA模板的制备与序列测定

2.1.6表位多肽的抗原性验证

2.2结果

2.2.1单克隆抗体纯化结果

2.2.2淘选的产率

2.2.3噬菌体ELISA检测结果

2.2.4噬菌体展示一致序列LFDGSNP

2.2.5 772LFDGTNP778为一个线性B细胞表位

2.3讨论

第三章猪瘟病毒E2单克隆抗体的制备及其抗原表位的初步鉴定

3.1材料与方法

3.1.1质粒、载体和生化试剂

3.1.2 CSFV E2基因的PCR扩增和克隆

3.1.3蜂素信号肽的获得

3.1.4转移载体的构建与鉴定

3.1.5定点突变

3.1.6重组杆粒的制备

3.1.7重组杆状病毒的制备

3.1.8重组蛋白的纯化

3.1.9 Western blot分析

3.1.10 ELISA检测

3.1.11重组E2蛋白的去糖基化

3.1.12小鼠免疫

3.1.13细胞融合

3.1.14阳性杂交瘤细胞的筛选

3.1.15阳性杂交瘤细胞的克隆化

3.1.16单克隆抗体的大量制备

3.1.1 7单克隆抗体的纯化

3.1.18 Western blot分析

3.1.19间接免疫荧光试验(IFA)

3.1.20单克隆抗体的亚型鉴定

3.1.21噬菌体展示肽库的生物淘选

3.1.22噬菌体夹心ELISA

3.1.23测序模板的制备与序列测定

3.2结果

3.2.1重组转移载体的获得

3.2.2重组杆粒的PCR鉴定

3.2.3 E2蛋白的纯化

3.2.4重组E2蛋白可被猪瘟特异性抗体所识别

3.2.5重组E2蛋白可形成二聚体

3.2.6 CSFV石门株和兔化弱毒疫苗株的重组E2蛋白分子量存在差异

3.2.7重组E2蛋白分子量的差异是由于糖基化程度不同

3.2.8 986N糖基化位点是功能性糖基化位点

3.2.9筛选出一株分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞

3.2.10单克隆抗体的Western blot检测

3.2.11单克隆抗体可以特异性识别猪瘟病毒

3.2.12单克隆抗体纯化结果

3.2.13淘选的产率

3.2.14噬菌体ELISA检测结果

3.2.15噬菌体展示一致序列YWH

3.3讨论

第四章全文结论

参考文献

致 谢

作者简历