动物源性成分的PCR检测及肉牛瘤胃细菌区系分析

摘要

本报告分为两部分： 1.为了防止疯牛病和绵羊痒病病原因子通过饲料传播，降低BSE传播到人的风险，我国对反刍动物中使用动物源性饲料产品(乳及乳制品除外)做出了禁止性规定。本研究建立了针对反刍动物饲料中常添加的牛、羊、猪、鸡、鱼成分的PCR检测方法，选择线粒体DNA为靶基因，设计并筛选引物，对引物的特异性和灵敏性进行检测。结果表明，所建立的PCR检测方法特异性较好，最低检出限在0.1％-0.05％。通过氯仿和次氯酸洗涤样品的方法还可以达到区分肉骨粉和奶粉的目的。 在对我国奶业主产区动物源性饲料使用情况调研抽样的基础上，对采集的364份样品进行检测，首先使用一对能够同时检测牛、羊、猪、鸡、鱼及其它动物成份的通用引物对含有动物源性成份的样品进行筛选，然后使用特异引物对含有动物源性成份的样品进行动物种类鉴别。结果表明有66份样品含有动物源性成分，占总样品数的18.1％；其中有18份检出牛源性成分、11份检出羊源性成分、26份检出猪源性成分，21份检出鸡源性成分、44份检出鱼源性成分。 结论：尽管我国已有相应政策法规出台，但依然存在以动物源性饲料饲喂反刍动物的现象，此外，动物源性饲料的生产中还存在一些掺假的现象，出于安全和质量需要求，进一步提高监督和检测力度很有必要。 2.食物中的顺9反11-共轭亚油酸(CLA)对人体健康有益。在反刍动物日粮中添加不饱和脂肪酸可提高乳和肉中CLA的含量，但不饱和脂肪酸对瘤胃细菌有一定的毒性作用。本研究旨在分析肉牛日粮中添加2％鱼油后瘤胃细菌区系的变化。分别于添加鱼油前后搜集瘤胃液提取总DNA，根据细菌通用引物27F/1492R扩增16SrDNA基因序列，分别构建两个16SrDNA基因文库，从每个文库中各随机挑取384个克隆，阳性克隆采用HhaⅠ进行限制性片段长度多态性(RFLP)分析、聚类，取各RFLP类群中的1个克隆进行16SrDNA序列测定，构建系统发育树分析细菌区系多样性的变化。RFLP分析表明添加鱼油前和添加鱼油后文库的RFLP图谱分别可以分成74和41个RFLP类群，序列测定结果表明：添加鱼油前后的优势菌群均为噬纤维菌-屈挠杆菌-拟杆菌(Cytophaga-Flexibacter-Bacteroides，CFB)和低G+C含量革兰氏阳性菌(lowG+CGrampositivebacteria，LGCGPB)，但是添加鱼油后文库中LGCGPB门细菌比例降低，而且未检测到纤维杆菌门细菌；序列测定结果表明：有50％-60％的测定序列与GenBank数据库中的序列相似性≥97％，90％以上为未培养的细菌，添加鱼油后瘤胃细菌的多样性减少。结论：日粮添加鱼油后CFB门细菌比例增高但多样性下降，LGCGPB门、纤维菌门细菌比例下降，为探索提高反刍动物乳和肉中CLA含量的瘤胃机制、更多地掌握瘤胃脂肪酸代谢和细菌之间的相互关系、认识更多的不可培养的细菌提供依据。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：图表清单

第1部分反刍动物饲料中动物源性成分的PCR检测

引言

1.动物源性饲料及饲料安全

2.动物源性饲料检测方法进展

3.本研究的目的和意义

1材料方法

1.1主要分子生物学试剂

1.2引物

1.3主要仪器设备

1.4试验样品的制备

1.5样品DNA提取

1.6区分肉骨粉和奶粉前处理

1.7 PCR扩增

1.8 PCR产物检测

1.9饲料样品检测

2.结果

2.1动物源性成份检测的通用引物PCR扩增法

2.2牛、羊、猪、鸡、鱼成分检测的特异PCR扩增法

2.3区分肉骨粉和奶粉的鉴别检测方法

2.4建立的PCR方法在饲料动物源性成份检测中的应用

3讨论

3.1 DNA提取方面

3.2灵敏性检测方面

3.3特异性检测方面

3.4引物的设计方面

3.5牛肉骨粉和奶粉区分方面

3.6抽样调查和检测方面

参考文献

第2部分日粮中添加鱼油后肉牛瘤胃微生物区系变化的分析

引言

1.基于16S rRNA/rDNA的胃肠道微生物多样性的研究方法

2.非16S rRNA/rDNA基础上的方法

3.影响胃肠道菌群多样性的因素

4.展望

5.研究目的意义

1.材料和方法

1.1瘤胃液的采集

1.2主要试剂和仪器

1.3瘤胃微生物基因组DNA提取

1.4 16S rDNA的PCR扩增

1.5 16S rDNA文库的构建

1.6 16S rDNA文库的鉴定

1.7 16S rDNA RFLP限制型内切酶的筛选

1.8 16S rDNA的PCR-RFLP分析

1.9代表克隆的测序分析

2结果

2.1基因组DNA的提取

2.2 16S rDNA的PCR扩增结果及文库中阳性克隆的PCR鉴定

2.3 RFLP限制型内切酶筛选结果

2.4 RFLP结果

2.5 RFLP代表克隆的序列测定、相似性比较及进化树分析

3讨论

3.1 PCR基础上微生物多样性分析的局限性

3.2 PCR-RFLP应用中的优缺点

3.3序列相似性及进化树构建

3.4瘤胃微生物区系变化分析

参考文献

致 谢

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