利用转基因小鼠模型进行转基因动物安全评价研究

摘要

近30年来，随着转基因动物技术的迅猛发展，不仅给农业和生物医药领域带来了革命性的变化，同时也引起了一系列相关的问题，如转基因动物及其产品的食用安全问题、伦理道德问题以及对生态环境的影响等。这些问题迫使世界各国都在加强对转基因动物的管理工作，制定完善的有关转基因动物及其食品安全的管理法规及标识制度。然而，这些法规制度的制定需要有健全的转基因动物检测体系来提供技术保障。本文主要从核酸水平对小鼠外源转基因成分检测技术进行了研究。 1)转基因阳性鼠的检测采用一步法抽提鼠尾基因组DNA,得到OD值在1.7-1.9之间的高质量DNA，首先用普通PCR检测得到阳性鼠，然后通过Southern杂交进行验证。结果显示：4个转基因后代中3个检测为阳性，一个没有检测到信号，但后面经过荧光定量PCR和TAIL-PCR检测证明，其也为转基因阳性。 2)外源基因结构检测建立多重PCR技术，在同一管中同时扩增一个内源基因和3个外源基因片段(包括外源目的基因、启动子和终止子)，扩增得到特异性好的4重PCR结果。表明此技术用于转基因动物检测可以大大提高工作效率和速度。 3)整合位点检测根据插入外源基因5'端序列设计特异性引物和小鼠基因密码子的偏好性设计随机引物，用TAIL-PCR检测4个转基因founder小鼠F1代阳性小鼠的外源基因插入位点。得出2个转基因小鼠的外源基因插入位点，分别插入在10号染色体的Sash1基因的第10内含子上和6号染色体Nxph1和AA545190基因间。 4)拷贝数检测选择小鼠单拷贝管家基因B2M作为内源基因，根据B2M和外源基因特异序列，利用BeaconDesigner2.0软件分别设计引物和探针，建立TaqMan实时荧光定量PCR技术。结果显示：外源基因TMEM66和内源基因B2M的real-timePCR的扩增标准曲线的相关系数分别为0.990和0.985，可以用于外源基因拷贝数的检测。计算得出11、49、52和55founder小鼠的外源基因拷贝数分别为623、3、22和10。

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第一章综述 转基因动物安全评价

1.1转基因动物安全评价概述

1.1.1转基因动物概念区分

1.1.2转基因动物研究历史

1.1.3转基因动物制作方法及应用

1.2转基因动物安全问题

1.2.1表型分析

1.2.2抽样

1.2.3售后监控

1.2.4内源病毒

1.2.5伦理问题

1.3转基因动物检测技术

1.3.1 DNA水平的检测

1.3.2插入位点检测

1.3.3拷贝数的检测

1.3.4表达外源蛋白的检测

1.3.5转基因动物个体水平的检测

第二章转基因阳性鼠检测

2.1试验材料

2.1.1试验动物

2.1.2主要试剂

2.1.3主要仪器

2.1.4主要试剂的配制

2.2试验方法

2.2.1总DNA提取

2.2.2 PCR检测

2.2.3 Southern杂交检测

2.3结果与分析

2.3.1 DNA提取

2.3.2 Southern杂交

2.4讨论

第三章转基因结构的检测

3.1试验材料

3.2试验方法

3.2.1单一PCR检测

3.2.2多重PCR检测

3.3结果与分析

3.3.1单一PCR结果

3.3.2多重PCR结果

3.4讨论

第四章外源基因整合位点的检测

4.1试验材料

4.2试验方法

4.2.1 TAIL-PCR引物设计与合成

4.2.2扩增体系和程序

4.2.3 PCR产物的鉴定

4.3结果与分析

4.3.1 TAIL-PCR扩增片段的克隆和测序

4.3.2外源基因插入区段侧翼序列分析

4.4讨论

第五章外源基因拷贝数的检测

5.1试验材料

5.2试验方法

5.2.1 TaqMan荧光定量PCR引物及探针设计

5.2.2普通PCR检测引物特异性及灵敏度

5.2.3质粒标准品的制备

5.2.4荧光定量PCR扩增体系和程序

5.2.5外源基因拷贝数的计算

5.3结果与分析

5.3.1 PCR检测敏感性和特异性

5.3.2荧光定量PCR标准曲线的制定

5.3.3外源基因拷贝数的计算

5.4小结与讨论

5.4.1内源基因的确定

5.4.2质粒标准品的制备

5.4.3相对定量方法的选择

5.4.4插入拷贝数对基因表达的影响

第六章结论

6.1主要结论

6.2创新点

参考文献

致谢

作者简历