微生物来源36家族α-半乳糖苷酶的基因克隆与性质研究

摘要

α-半乳糖苷酶(α-galactosidase，α-D-galactosidegalactohydrolase；EC3.2.1.22)也称蜜二糖酶，是一种外切糖苷酶，催化移除不同底物中α-连接的末端非还原性D-半乳糖。α-半乳糖苷酶在医疗、食品、化工及饲料等方面有着广泛的应用。在饲料工业中。α-半乳糖苷酶添加剂是去除豆粕中α-半乳糖苷寡糖类抗营养因子的首选方法。饲用α-半乳糖苷酶的生产目前尚未形成产业化，其中，性质优良的α-半乳糖苷酶的发掘是一个亟待解决的关键问题。 本研究通过对菌种新颖性和产酶能力的评估，确定了根霉F78(Rhizopussp.F78)、赤霉F75(Gibberellasp.F75)、链霉菌(Streptomycessp.)S9和S27及耶尔森氏菌(YersiniapestisbiovarMicrotusstr.91001)为本实验的研究对象。根霉和赤霉都是重要的工业菌种，但未见这2个属中α-半乳糖苷酶基因克隆与表达的相关报道。链霉菌S9和S27是分离自火焰山的2个菌株，生长条件特殊。 利用生物信息学的方法，对微生物来源糖苷水解酶36家族的α-半乳糖苷酶序列进行比对和分析，总结该家族的酶蛋白在分子最大小上的差异，进行分类、分析和简并引物设计，通过简并PCR扩增得到来源于研究菌株中编码α-半乳糖苷酶的基因片断，再结合不同的基因克隆方法最终获得这些基因的全序列。因此，基于这对保守基序设计的简并引物可以有效的扩增到糖苷水解酶36家族的α-半乳糖苷酶基因。 对5个实验菌株中获得的α-半乳糖苷酶基因进行BLAST比对，分析其编码的氨基酸序列与已报道的α-半乳糖苷酶的氨基酸序列的相似性。结果表明来源于根霉F78的α-半乳糖苷酶Aga-F78最高相似性为45％，赤霉F75的α-半乳糖苷酶Aga-F75最高相似性为69％，链霉菌S9的α-半乳糖苷酶Aga-S9最高相似性为36％，链霉菌S27的α-半乳糖苷酶Aga-S27最高相似性为55％，耶尔森氏菌的α-半乳糖苷酶Aga-Y最高相似性为57％，而5个酶相互之间的相似性介于25-40％。因此，这5个α-半乳糖苷酶基因均具有很高的新颖性。 5个α-半乳糖苷酶基因均在大肠杆菌中异源表达，并验证其基因功能，酶纯化后进行了详细的酶学性质研究。5个α-半乳糖苷酶的性质比较表明，真菌来源的α-半乳糖苷酶最适pH值偏酸性，在4.0-5.0间，而细菌来源的则在7.0-7.5的中性范围内；温度特性上，真菌来源的α-半乳糖苷酶最适温度在50-60℃，细菌来源的在35-40℃，Aga-F75-H、Aga-F78-H、Aga-S27-H热稳定性较好；Aga-F75-H和Aga-F78-H对多种蛋白酶有良好的抗性；Aga-Y-H具有一定适冷酶特性，这在其它α-半乳糖苷酶的研究中还未见报道。因此，获得的这些性质各异的α-半乳糖苷酶，不仅具有在不同领域的实际应用价值，也为研究其结构和功能提供了良好的材料。 饲料添加剂中，α-半乳糖苷酶常需要与蛋白酶共同作用，以提高饲料中营养物的利用率。另外，酶蛋白对胃肠道内蛋白酶的抗性，可以延长其作用时间，提高其利用效率。所获得的α-半乳糖苷酶与胰蛋白酶共作用降解豆粕的试验显示，其中4种酶单独作用时都可较大幅度提高半乳糖的含量。Aga-F75-H、Aga-F78-H和Aga-S27-H与胰蛋白酶共作用不影响α-半乳糖苷酶的降解能力。对于Aga-F75-H，单独作用时使半乳糖的含量增加了82.42倍，添加胰蛋白酶后降解量又进一步增加了约36％。这些酶学性质表明Aga-F75-H、Aga-F78-H和Aga-S27-H，特别是Aga-F75-H具有很好的饲料工业应用前景。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章引言

1 α-半乳糖苷酶的研究进展

1.1 α-半乳糖苷酶的来源

1.2 α-半乳糖苷酶的酶学特性

1.3 α-半乳糖苷酶的分类

1.4 α-半乳糖苷酶的分子特性

2 α-半乳糖苷酶的应用

2.1 α-半乳糖苷酶与豆粕饲料

2.2 α-半乳糖苷酶与食品工业

2.3 α-半乳糖苷酶与医疗

2.4 α-半乳糖苷酶与其他工业

3 α-半乳糖苷酶基因工程的研究

4基因克隆技术的研究进展

4.1构建基因组文库

4.2 Tail-PCR技术

4.3 3'RACE和5'RACE(rapid amplificationof cDNA ends)

4.4简并PCR(Degenerate PCR)

5大肠杆菌表达系统的研究进展

5.1表达载体

5.2宿主细胞

5.3大肠杆菌中外源蛋白的高效表达策略

6研究的目的和意义

第二章 来源于根霉(Rhizopus sp.F78)α-半乳糖苷酶基因的克隆、表达和酶学性质

1.实验材料

1.1菌株与质粒

1.2引物合成

1.3试剂盒、工具酶和生化试剂

1.4仪器

1.5培养基

1.6常用溶液

2.实验方法

2.1根霉F78产酶能力的验证

2.2根霉F78菌种鉴定

2.3来源于根霉F78的α-半乳糖苷酶基因aga-F78的克隆

2.4原核表达载体pET-22b(+)lic/aga-F78-H的构建

2.5重组酶Aga-F78-H与原酶Aga-F78分离纯化与性质研究

3结果与分析

3.1菌株F78产酶能力的验证

3.2产α-半乳糖苷酶菌株F78的鉴定

3.3.α-半乳糖苷酶基因aga-F78的克隆、表达

3.4重组酶Aga-F78-H与原酶Aga-F78的纯化及蛋白性质

3.5重组酶Aga-F78-H与原酶Aga-F78酶学性质研究

4讨论

4.1重组酶Aga-F78-H的克隆、表达

4.2重组酶Aga-F78-H与原酶Aga-F78的性质比较分析

本章小结

第三章 来源于赤霉(Gibberela sp.F75)α-半乳糖苷酶基因的克隆、表达和酶学性质

1实验材料

1.1菌株与质粒

1.2引物合成

1.3试剂盒、工具酶和生化试剂

1.4仪器

1.5培养基

1.6常用溶液

2实验方法

2.1赤霉F75产酶能力的验证

2.2赤霉F75的菌种鉴定

2.3 α-半乳糖苷酶基因aga-F75的克隆

2.4原核表达载体pET-22b(+)/aga-F75-H的构建

2.5重组酶Aga-F75-H的纯化

2.6重组酶Aga-F75-H酶学性质测定

2.7重组酶Aga-F75-H比活性测定

2.8重组酶Aga-F75-H底物特异性的测定

2.9重组酶Aga-F75-H对豆粕降解能力的研究

3结果与分析

3.1产α-半乳糖苷酶的菌株F75的分子鉴定

3.2赤霉F75产酶能力的验证

3.3α-半乳糖苷酶基因aga-F75的克隆

3.4原核表达载体pET-22b(+)/aga-F75-H的构建

3.5重组酶Aga-F75-H的诱导表达与纯化

3.6重组酶Aga-F75-H酶学性质测定

3.7 Aga-F75-H底物特异性的测定

3.8重组酶Aga-F75-H对豆粕降解能力的研究

4讨论

本章小节

第四章 来源于链霉菌S9(Streptomyces sp.S9)α-半乳糖苷酶基因的克隆、表达和酶学性质

1实验材料

1.1菌株与质粒

1.2引物合成

1.3试剂盒、工具酶和生化试剂

1.4仪器

1.5培养基

1.6常用溶液

2实验方法

2.1链霉菌S9产酶能力的验证

2.2 α-半乳糖苷酶基因aga-S9的克隆

2.3原核表达载体pET-28a(+)/aga-S9-H的构建

2.4重组酶Aga-S9-H的纯化

2.5重组酶Aga-S9-H酶学性质测定

2.6重组酶Aga-S9-H比活性测定

2.7重组酶Aga-S9-H底物特异性的测定

2.8重组酶Aga-S9-H对豆粕降解能力的研究

3结果与分析

3.1链霉菌S9产酶能力的验证

3.2α-半乳糖苷酶基因aga-S9的克隆

3.3原核表达载体pET-28a(+)/aga-S9-H的构建

3.4重组酶Aga-S9-H的诱导表达与纯化

3.5重组酶Aga-S9-H酶学性质测定

3.6重组酶Aga-S9底物特异性的测定

3.7重组酶Aga-S9-H对豆粕降解能力的研究

4讨论

本章小节

第五章来源于链霉菌S27(Streptomyces sp.S27)α-半乳糖苷酶基因的克隆、表达和酶学性质

1实验材料

1.1菌株与质粒

1.2引物合成

1.3试剂盒、工具酶和生化试剂

1.4仪器

1.5培养基

1.6常用溶液

2实验方法

2.1链霉菌S27产酶能力的验证

2.2 α-半乳糖苷酶基因aga-S27的克隆

2.3原核表达载体pET-28a(+)/aga-S27-H的构建

2.4重组酶Aga-S27-H的纯化

2.5重组酶Aga-S27-H酶学性质测定

2.6重组酶Aga-S27-H比活性测定

2.7重组酶Aga-S27-H底物特异性的测定

2.8重组酶Aga-S27-H对豆粕降解能力的研究

3结果与分析

3.1链霉菌S27产酶能力的验证

3.2 α-半乳糖苷酶基因aga-S27的克隆

3.3原核表达载体pET-28a(+)/aga-S27-H的构建

3.4重组酶Aga-S27-H的诱导表达与纯化

3.5重组酶Aga-S27-H酶学性质测定

3.6 Aga-S27-H底物特异性的测定

3.7重组酶Aga-S27-H对豆粕降解能力的研究

4讨论

本章小节

第六章来源于鼠疫耶尔森氏菌91001(Yersinia pestis biovar Microtus str.91001)α-半乳糖苷酶的基因克隆、表达和酶学性质

1实验材料

1.1菌株与质粒

1.2引物合成

1.3试剂盒、工具酶和生化试剂

1.4仪器

1.5培养基

1.6常用溶液

2实验方法

2.1α-半乳糖苷酶基因aga-Y的克隆

2.2原核表达载体pET-22b(+)/aga-Y-H的构建

2.3重组酶Aga-Y-H的纯化

2.4重组酶Aga-Y-H酶学性质测定

2.5重组酶Aga-Y-H比活性测定

2.6重组酶Aga-Y-H底物特异性的测定

2.7重组酶Aga-Y-H对豆粕降解能力的研究

3结果与分析

3.1 α-半乳糖苷酶基因aga-Y的克隆

3.2原核表达载体pET-22b(+)/aga-Y-H的构建

3.3重组酶Aga-Y-H的诱导表达与纯化

3.4重组酶Aga-Y-H酶学性质测定

3.5 Aga-Y-H底物特异性的测定

3.6重组酶Aga-Y-H对豆粕降解能力的研究

4讨论

本章小节

第七章讨论

1菌株及其诱导培养基的选择

1.1诱导培养基的选择及诱导条件的探索

1.2菌株的选择

2.微生物36家族α-半乳糖苷酶的分析及简并引物的设计与应用

3 α-半乳糖苷酶的异源表达研究

3.1表达载体的选择

3.2 α-半乳糖苷酶在大肠杆菌中的表达位置

3.3 α-半乳糖苷酶在大肠杆菌中的表达条件

4五个微生物来源36家族α-半乳糖苷酶重组酶性质特点

4.1分子特性及酶学性质的比较

4.2动力学

5五个微生物来源36家族α-半乳糖苷酶降解能力的研究

5.1天然底物降解试验

5.2豆粕降解实验

第八章结论

参考文献

致谢

作者简历