重组马白细胞介素-18的鉴定及其定量抗原捕获ELISA检测方法的建立

摘要

白细胞介素-18(IL-18)是一种重要的细胞因子，它能作用于I型辅助性T细胞(Th1)，并在IL-12的协同作用下能强烈诱导其产生IFN-γ。近来研究表明：IL-18具有广泛的生物学活性，在介导细胞免疫、抵抗微生物感染和抗肿瘤方面起着重要的作用。因此，IL-18在临床上可作为免疫增强剂、抗微生物或抗肿瘤制剂得以应用。到目前为止，国内外已有人、小鼠、猴、猪、牛和羊等种属的IL-18商品化制剂及其相应的单克隆抗体(McAb)或多克隆抗体(PcAb)以及夹心ELISA试剂盒的商品化供应。然而，有关马IL-18(EIL18)的研究较少且相对滞后，迄今为止，还未见有可供商品化的EIL-18和抗EIL-18McAb或PcAb及其夹心ELISA试剂盒等相关产品。 本研究采用RT-PCR从经ConA刺激的马外周血单核细胞(PBMCs)，中扩增获得编码EIL-18前体蛋白(precursorEIL-18，pEIt-18)的DNA，然后克隆至载体PMD18-T中，鉴定正确的重组质粒命名为PMD-EIL-18。 自PMD-EIL-18中分别扩增pEIL-18及其成熟蛋白(matureEIL-18，mEIL-18)基因，并将其亚克隆至原核表达载体pET-28a(+)和PET-26b(+)中，重组质粒鉴定正确后命名为pET-pEIL-18、pET-EIL-18和pET-mEIL-18。 然后分别转化至大肠杆菌感受态BL21(DE3)中进行诱导表达，表达产物经SDS-PAGE分析，结果表明所得到重组蛋白分别约为25kD、20kD和18kD，经Western-blot鉴定结果表明这3种重组蛋白均能与兔抗人IL-18发生免疫学反应，将这3种表达的重组蛋白分别命名为rpEIL-18、rEIL-18和rmEIL-18。 在此基础上，本研究建立了rpEIL-18、rEIL-18和rmEIL-18在非变性状态下通过镍柱亲和层析或偶联了抗EIL-18McAb的CNBr-activatedSepharose4B亲和层析纯化重组蛋白的方法，采用该方法纯化获得了高纯度的重组蛋白rpEIL-18、rEIL-18和rmEIL-18。 为鉴定所获得的重组蛋白rpEIL-18、rEIL-18和rmEIL-18是否具有生物学活性，本研究还建立了一种检测马IFN-γmRNA拷贝数的实时荧光定量RT-PCR方法，并采用本方法评价了rpEIL-18、rEIL-18和rmEIL-18在重组人白细胞介素-12(rhIL-12)协同下在体外刺激马PBMCs所产生IFN-γ的状况。结果表明，rpEIL-18不具有相应的生物学活性，而rEIL-18和rmEIL-18具有类似天然EIL-18生物学活性的特性： 利用上述纯化后的rEIL-18抗原免疫新西兰白兔，制各了高效价的抗EIL-18PCAb。 同时，采用相同抗原免疫BALB/c小鼠，取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，以昆虫/杆状病毒表达系统获得的重组mEIL-18(rAcEIL-18)作为检测抗原进行间接ELISA检测，共筛选获得9株能稳定分泌抗体的单细胞克隆株。利用Western-blot和IFA实验对9株单克隆抗体(McAbs)进行鉴定，结果显示，所获得的9株细胞分泌的抗体均能与rEIL-18和rAcEIL-18发生特异性反应。将此9株McAbs分别与用原核系统分段表达的重组马白细胞介素-18成熟蛋白mEIt-181-78和mEIL-1879-157进行特异性ELISA检测，结果表明，其中5株能识别所表达的mEIL-181-78，而另外4株能与mEIL-1879-157发生反应，说明所获得的9株McAbs至少能针对rmEIL-182个或2个以上不同的抗原表位。采用单克隆抗体亚型鉴定试剂盒对该9株McAbs进行亚型鉴定，结果表明，除M1F11、M3A11和N7D9为IGM，其余的McAbs均为IgG1，而且所有McAbs的轻链均为K链。将9株McAbs分别与rEIL-18和rmEIL-18进行中和活性测定，结果表明SID7株对有生物活性的rEIL-18和rmEIL-18均具有中和效应。 将抗EIL-18的McAbs和PcAb进行粗提和亲和层析纯化，并对纯化后S6A3和B1G1株McAbs和PcAb进行生物素标记。通过对各株McAb或PcAb分别作为捕获抗体或检测抗体进行初步的配对筛选后，以亲和纯化的S6A3株McAb作为捕获抗体，生物素标记的B1G1株McAb作为检测抗体，经方阵试验优化抗原捕获ELISA反应体系，以不同浓度梯度的rEIL-18为捕获抗原进行ELISA检测绘制其OD值-抗原浓度标准曲线，确定检测灵敏度为15pg/mL采用所建立的抗原捕获ELISA检测方法对健康和EIAV感染的马血清及猪、牛、羊血清进行检测，结果表明，猪血清、牛血清和羊血清在该检测方法中均无发生交叉反应性，健康马血清中EIL-18的含量在40-80pg/mL之间，而EIAV感染后的马血清中EIL-18含量略微升高，在70-150pg/mL之间。 由于各种属的IL-18存在一定的交叉反应性，为了检测本研究所获得抗EIL-18McAbs是否能够用于检测其他种属IL-18并确定其检测极限，参照配对筛选结果和上述建立好的EIL-18定量抗原捕获ELISA检测方法，以S1C6株McAb作为捕获抗体，生物素化的抗EIL-18PcAb为检测抗体，商品化的重组猪IL-18(rPIL-18)为捕获抗原绘制OD值-抗原浓度标准曲线，确定检测灵敏度为30pg/mL，建立了基于抗EIL-18抗体为检测和捕获抗体的猪IL-18(PIL-18)定量抗原捕获ELISA检测方法；以S5F1株McAb作为捕获抗体，生物素化的抗EIL-18PcAb为检测抗体，初步建立了以抗EIL-18抗体为检测和捕获抗体的牛IL-18(BIL-18)定量抗原捕获EILSA检测方法。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略表

声明

第一章绪论

1.1白细胞介素-18简介

1.1.1 IL-18结构及组织分布

1.2.1 IL-18生物学特性

1.3.1 IL-18在疾病中的角色

1.4.1 IL-18的应用性研究

1.2马白细胞介素-18研究现状

1.2.1马IL-18基因的克隆及其重组蛋白的表达

1.2.2其它种属IL-18基因的克隆及其重组蛋白的表达

1.2.3抗马IL-18 McAb及其检测方法

1.2.4其它种属IL-18 McAb及其检测方法

1.3本研究的主要内容和意义

第二章马白细胞介素-18的基因克隆、构建、表达、纯化及生物学活性鉴定

2.1材料

2.1.1实验动物

2.1.2质粒与菌种

2.1.3主要试剂

2.1.4主要溶液和培养基的配制

2.1.5主要仪器

2.2方法

2.2.1引物的设计

2.2.2马PBMCs的分离及其总RNA的提取

2.2.3目的基因的扩增及其克隆

2.2.4所扩增EIL-18基因的进化分析

2.2.5pET-pEIL-18、pET-EIL-18和pET-mEIL-18表达载体的亚克隆

2.2.6pET-pEIL-18、pET-EIL-18和pET-mEIL-18在E.coli中的表达及条件的优化

2.2.7目的蛋白的鉴定

2.2.8目的蛋白rpEIL-18、rEIL-18和rmEIL-18的纯化

2.2.9目的蛋白rpEIL-18、rEIL-18和rmEIL-18浓度测定

2.2.10 rpEIL-18、rEIL-18和rmEIL-18生物活性的鉴定

2.2.11 EIL-18分子内或分子间二硫键的预测

2.3结果

2.3.1 EIL-18基因的克隆、序列测定及其分析

2.3.2 pET-pEIL-18、pET-EIL-18和pET-mEIL-18重组质粒的构建和鉴定

2.3.3 pET-pEIL-18、pET-EIL-18和pET-pEIL-18在E.coli中的表达及鉴定

2.3.4表达条件的优化

2.3.5 rpEIL-18、rEIL-18和rmEIL-18蛋白的纯化及浓度测定

2.3.6 rpEIL-18、rEIL-18和rmEIL-18蛋白的生物活性鉴定

2.3.7.EIL-18分子二硫键的预测

2.4讨论

第三章抗EIL-18多克隆抗体和单克隆抗体的制备与特性鉴定

3.1材料

3.1.1重组杆状病毒和细胞系

3.1.2实验动物

3.1.3主要试剂

3.1.4主要溶液和培养基的配制

3.1.5主要仪器

3.2方法

3.2.1免疫抗原和检测抗原的制备

3.2.2间接ELISA检测方法的建立

3.2.3多克隆抗体的制备及效价确定

3.2.4细胞融合

3.2.5杂交瘤细胞的选择性培养及单克隆抗体的筛选检测

3.2.6杂交瘤细胞的克隆化及冻存和复苏

3.2.7单克隆抗体腹水的制备

3.2.8杂交瘤细胞及单克隆抗体特性的鉴定

3.2.9抗EIL-18单克隆抗体的表位初步鉴定

3.2.10抗EIL-18单克隆抗体的相对亲和力的测定

3.3结果

3.3.1免疫抗原和检测抗原的制备

3.3.2间接ELISA检测方法的建立

3.3.3多克隆抗体效价检测

3.3.4杂交瘤细胞株的获得

3.3.5抗EIL-18杂交瘤细胞株腹水效价及抗体分泌稳定性的测定

3.3.6单克隆抗体的Western-blot鉴定

3.3.7间接免疫荧光(IFA)检测

3.3.8单克隆抗体的中和活性

3.3.9单克隆抗体的亚型鉴定

3.3.10抗EIL-18单克隆抗体的表位初步鉴定

3.2.11抗EIL-18单克隆抗体的相对亲和力的测定

3.4讨论

第四章EIL-18定量抗原捕获ELISA检测方法的建立

4.1材料

4.1.1主要试剂

4.1.2主要溶液的配制

4.1.3主要仪器

4.2方法

4.2.1抗EIL-18 PcAb的纯化及标记

4.2.2抗EIL-18 McAbs的纯化及标记

4.2.3生物素标记水平的测定

4.2.4生物素标记PcAb和McAb效价的测定

4.2.5捕获抗体与检测抗体配对的选择

4.2.6包被液的选择

4.2.7捕获抗体包被浓度的选择

4.2.8检测抗体工作浓度的选择

4.2.9封闭剂的选择

4.2.10标准曲线的绘制及最小检出浓度的确定

4.2.11特异性试验

4.2.12重复性和稳定性试验

4.2.13临床初步应用

4.2.14猪、牛IL-18定量抗原捕获ELISA检测方法的初步建立

4.3结果

4.3.1抗EIL-18 PcAb和McAbs的纯化

4.3.2抗EIL-18 McAbs的纯化

4.3.3抗EIL-18 PcAb和McAbs的生物素标记

4.3.4生物素标记抗EIL-18 PcAb和McAbs的检测结果

4.3.5包被液的选择

4.3.6捕获抗体包被浓度的选择

4.3.7检测抗体工作浓度的选择

4.3.8封闭剂的选择

4.3.9标准曲线的绘制及最小检出浓度的确定

4.3.10鉴定特异性试验

4.3.11重复性和稳定性试验

4.3.12临床检测结果

4.3.13猪、牛IL-18定量抗原捕获ELISA检测方法的初步建立

4.4讨论

第五章全文结论

参考文献

致 谢

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