一株新型氨氮降解菌株的分离鉴定及相关功能基因的克隆

摘要

氨氮是水体中主要的污染物之一，是引起水质恶化、导致养殖水体中水生动物大量死亡的主要原因。生物脱氮法是被公认为更经济、有效、对环境影响小的方法，也是最有发展前途的污水处理方法。但传统生物脱氮途经一般要经过好氧硝化和缺氧反硝化两个过程，工艺复杂，成本高，因此分离同时具有硝化、反硝化能力的异养硝化菌，并进行基因改造，实现低成本氨氮污染水体的修复，已成为国内外的研究热点。 本论文采用以氨氮为唯一氮源的异养硝化培养基，通过极度稀释和划线分离等方法，筛选获得一株能高效降解氨氮的菌株NP1。经光镜和扫描电镜观察、生理生化鉴定和16SrRNA基因同源性分析证明：NP1菌株为中华根瘤菌(Sinorhizobiumsp.)。代谢产物分析表明：NP1在氨氮降解中无硝酸盐、亚硝酸盐、羟胺等有毒物质的积累，氨氮能通过同化作用或异化成含氮气体去除。 NP1理化性质实验结果表明：(1)不同有机碳源对NP1脱氮影响不同，对不同有机碳源的利用能力大小为：乙酸钠＞琥珀酸钠＞柠檬酸钠＞丙酸钠＞蔗糖＞乳糖＞酒石酸钾钠＞乙醇(2)NP1低温下氨氮降解能力高，高温下降解能力低。最适氨氮降解温度范围宽，在20～30℃间，氨氮降解效率无显著差异；37℃降解能力降低2/3以上。(3)NP1在pH5～8范围内均有较好的脱氮效果，但在酸性条件下菌株生长有一适应期。(4)NP1能适应的C/N范围较宽，在C/N1～10范围内均有很好的脱氮效果。(5)NP1在最适条件下48小时对氨氮的降解率接近100％。 采用同源克隆技术，对NP1降解氨氮的关键酶基因进行了克隆，分别获得氨单加氧酶基因(amo)片段，含Cu型亚硝酸盐还原酶基因片段和周质硝酸盐还原酶大亚基NapA基因片段。相关序列测定及相似性分析表明：amo基因片段与几株中华根瘤菌属菌株的疑是氨单加氧酶基因相似性较高，但与自养硝化菌的氨单加氧酶基因无相似性，与已报道的异养硝化菌的疑是氨单加氧酶基因也只在小部分区段具有一定的相似性，这表明克隆到的NP1菌株的氨单加氧酶与已报道的其他硝化菌的氨单加氧酶存在较大差异。序列跨膜螺旋信号分析结果显示该序列存在多个跨膜区，这与已报道的氨单加氧酶为膜结合蛋白相符。结构域预测结果表明该序列中存在典型的AmoA蛋白家族结构域。 利用基因保守区设计的引物进行PCR扩增，我们扩增到了含Cu型亚硝酸盐还原酶基因片段和周质硝酸盐还原酶大亚基NapA基因片段，这从基因水平上证明了菌株NP1中反硝酶系的存在。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略表

声明

第一章绪论

1.1氮污染的危害、来源及现状

1.1.1氮污染的危害

1.1.2氮污染的来源

1.1.3我国氮污染现状

1.2污水脱氮技术

1.2.1污水脱氮技术分类及其优缺点

1.2.2生物脱氮技术

1.3异养硝化作用和好氧反硝化作用

1.3.1异养硝化作用

1.3.2好氧反硝化作用

1.4异养硝化作用和好氧反硝化作用分子生物学研究现状

1.4.1异养硝化作用关键酶及其相应基因

1.4.2好氧反硝化作用关键酶及其相应基因

1.5展望

1.6本课题研究目的、意义

1.6.1研究目的

1.6.2研究意义

第二章异养硝化细菌的分离与鉴定

2.1材料

2.1.1试剂

2.1.2仪器

2.1.3培养基

2.2方法

2.2.1氨氮降解菌株的富集培养及分离纯化

2.2.2菌株脱氮活性测定方法

2.2.3筛选菌株的鉴定

2.3结果

2.3.1氨氮降解菌株的筛选和分离纯化

2.3.2菌株NP1氨氮降解曲线测定

2.3.3菌株NP1的鉴定

2.4讨论

2.5小结

第三章 Sinorhizobium sp.NP1脱氮条件及机理的初步研究

3.1材料

3.1.1试剂

3.1.2仪器

3.1.3培养基

3.1.4菌株

3.2方法

3.2.1 Sinorhizobium sp.NP1实验室脱氮条件研究

3.2.2 Sinorhizobium sp.NP1脱氮过程中氨气生成量的检测

3.2.3 Sinorhizobium sp.NP1氨氮耐受性实验

3.3 Sinorhizobium sp.NP1代谢产物的测定

3.3.1检测方法

3.3.2以氨氮为唯一氮源的代谢过程

3.3.3以亚硝酸盐氮为唯一氮源的代谢过程

3.3.4以硝酸盐氮为唯一氮源的代谢过程

3.4结果

3.4.1最佳碳源实验

3.4.2温度对氨氮降解率的影响

3.4.3 pH对氨氮降解率的影响

3.4.4不同C/N比(质量比)对氨氮降解率的影响

3.4.5 Sinorhizobium sp.NP1脱氮过程中氨气生成量

3.4.6 Sinorhizobium sp.NP1氨氮耐受性实验

3.4.7以氨氮为唯一氮源代谢过程

3.4.8亚硝酸盐氮为唯一氮源代谢过程

3.4.8硝酸盐氮为唯一氮源代谢过程

3.5讨论

3.6 小结

第四章 Sinorhizobium sp.NP1脱氮关键酶基因研究

4.1材料

4.1.1菌株与质粒

4.1.2引物合成

4.1.3试剂

4.1.4仪器

4.2方法

4.2.1氨单加氧酶基因的克隆

4.2.2亚硝酸盐还原酶基因的克隆

4.2.3周质硝酸盐还原酶基因的克隆

4.3结果

4.3.1氨单加氧酶基因的克隆

4.3.2亚硝酸盐还原酶基因的克隆

4.3.3周质硝酸盐还原酶基因的克隆

4.4讨论

4.5小结

第五章全文结论

参考文献

附录

致谢

作者简历