猪繁殖与呼吸综合征病毒国内流行毒株的分离、鉴定及其遗传变异分析

摘要

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome.PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus.PRRSV)引起的一种以妊娠母猪严重繁殖障碍以及仔猪的呼吸道症状和高死亡率为特征的传染病。PRRS自1987年首次报道发现于美国以来，现已遍及世界各主要养猪国家与地区，并已成为危害养猪业最严重的传染病之一。我国在2006年春夏交接之际，南方地区发生了以高热、高发病率和高死亡率为特征的传染病，而后迅速蔓延至周边地区，至2007年已遍及全国绝大部分省份。目前普遍认为该疫情是由高致病性PRRSV变异株及其他病原微生物在混合感染的条件下所致。 1.本研究用Marc-145细胞系于2005年从广东地区疑似PRRSV感染猪场分离到3株PRRSV，命名为GD1～GD3；于2006年从江苏地区疑似PRRSV感染猪场分离到5株PRRSV，分别命名为JS1-JS5。采用RT-PCR、IFA对这8个分离毒株进行鉴定，并在Marc-145细胞上完成了病毒的增殖、TCID50的测定和理化性质的鉴定。 2.选择JS1、JS5和GD3进行全基因组序列的扩增。采用5'FullRACE技术及RT-PCR技术，分段设计引物，分别扩增并克隆了3个分离毒株的所有cDNA片段，测序后拼接获得了3个分离毒株的全基因组序列。JS1、JS5和IGD3基因组全长分别为15319nt，15318nt和15408nt(不包括PolyA尾巴)。序列比较显示三者的基因结构相同。GD3在Nsp2存在1个氨基酸的缺失；JS1和JS5的Nsp2存在30个氨基酸的缺失。进化分析表明这3个分离毒株均为美洲型PRRSV。 3.对22份分离自国内不同省份的PRRSV进行ORF5基因的扩增，分析表明所有的分离毒株均为美洲型。分离毒株推导的氨基酸的相似性为90.0％～99.5％，与VR-2332的相似性为86.6％～90.5％，与CH-1a的相似性为91.5％～99.0％。采用分子生物学软件绘制了PRRSV的遗传演化关系图，表明我国流行的PRRSV毒株分为2个亚群：以CH-1a为代表的包含JXA1，HUN4等高致病性变异毒株在内的毒株为亚群1；以VR-2332为代表的包含少数国内分离毒株为亚群2。

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论文说明：英文缩略表

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第一章绪论

1.1猪繁殖与呼吸综合征概述

1.1.1历史

1.1.2病原学特点

1.1.3流行病学

1.1.4分子生物学研究进展

1.1.5疫苗研究进展

1.2研究目的和意义

第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒国内流行毒株的分离与鉴定

2.1材料和方法

2.1.1病料样本的处理

2.1.2 RT-PCR相关试剂及溶液的配置

2.1.3病毒分离培养用细胞及培养基

2.1.4鉴定所用荧光抗体及试剂

2.1.5主要仪器设备

2.2方法

2.2.1 RNA的提取

2.2.2 PCR引物的设计

2.2.3 RT-PCR

2.2.4 PRRSV的分离

2.2.5间接免疫荧光试验

2.2.6 PRRSV分离毒株理化性质的鉴定

2.3结果与分析

2.3.1 RT-PCR检测

2.3.2分离毒株的培养特性

2.3.3间接免疫荧光试验

2.3.4 PRRSV分离毒株理化性质的鉴定

2.4讨论

2.4.1病料的采集

2.4.2 PRRSV的分离及细胞嗜性

2.5 小结

第三章猪繁殖与呼吸综合征病毒国内分离毒株全基因组序列的测定及序列分析

3.1材料和方法

3.1.1毒株、菌种、克隆载体

3.1.2酶及试剂

3.1.3主要仪器设备

3.2方法

3.2.1 PRRSV的增殖

3.2.2 PRRSV分离毒株各个片段的扩增

3.2.3 PCR产物的鉴定与回收纯化

3.2.4 PCR产物连接与阳性克隆质粒的鉴定

3.2.5 PRRSV全基因组序列的拼接及分析

3.3结果与分析

3.3.1 PRRSV基因组分段RT-PCR扩增结果

3.3.2 PRRSV全基因组序列的拼接及分析

3.4讨论

第四章猪繁殖与呼吸综合征病毒国内分离毒株ORF5序列的测定及序列分析

4.1材料与方法

4.1.1病毒与细胞

4.1.2实验试剂

4.1.3引物

4.1.4病毒RNA的提取及RT-PCR

4.1.5 ORF5片段的回收和测序

4.2结果

4.2.1分离毒株核苷酸序列相似性的比较及其推导的氨基酸的相似性的比较

4.2.2依据ORF5基因核苷酸序列的遗传演化分析

4.2.3 ORF5基因推导编码GP5的氨基酸的比较

4.2.4毒力相关氨基酸的变异

4.3讨论

第五章全文结论

参考文献

致 谢

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