棉花生殖发育相关基因簇的结构和功能分析

摘要

棉花是具有战略意义的农作物，如何提高棉花产量、改善棉花品质，历来受到了研究者的高度重视。由于棉花的经济价值主要通过其生殖器官的发育好坏体现，因此对其生殖发育进行深入研究，将是实现培育高产优质棉花的重要突破口。 本论文根据以往的研究，推断在紧密连锁且同在生殖器官中特异表达的arf1和nodulin-like基因附近存在着一个与生殖发育相关的基因簇。从这一推断着手，开展了相应的研究，以期能够深入认识棉花的生殖发育机理，为高产优质棉花的培育提供坚实的理论依据和物质基础。 首先，根据已知的arf1和nodulin-like基因设计了三对PCR引物，通过PCR池筛法对棉花18RBAC文库进行了筛选，获得了两个包含这两个基因的BAC克隆G2-J-15和G128-K-15，通过酶切鉴定其插入片段大小分别为38kb和90kb。选取了插入片段较小的G2-J-15进行了全序列测序。 通过对G2-J-15的全序列测序和相关生物信息学分析发现，在短短的38kb序列中一共分布了7个基因，平均每5kb就存在一个基因，说明该基因簇位于基因富集区。除了已知的arf1和nodulin-like基因外，通过基因结构预测和BLAST，还发现了未在棉花中克隆过的GhGolS(肌醇半乳糖苷合酶基因)、GhAPm(AP复合体μ亚基基因)、GhPsbP(PSⅡ放氧复合体外周蛋白基因)和GhNeuF(中性β-呋喃果糖苷酶基因)，此外，还发现了一个未在任何物种中发现过的未知基因。对这5个新基因进行了一系列的生物信息学分析，了解了它们的基因结构，对蛋白质的性质、结构和功能也有了一定的了解。对这些基因进行生物信息学分析，发现了一个非常有趣的现象，即GhGolS、GhAPm和GhNeuF在棉花基因组中的排列顺序和方向与其在拟南芥中同源基因的排列顺序和方向一模一样，甚至棉花GhAPm和GhNeuF基因之间间隔了两个基因，而拟南芥中与之同源的基因之间同样间隔了两个基因。该基因簇在结构上异常的保守性预示着该基因簇的功能可能也非常保守，对棉花的生长发育起着至关重要的作用。 利用real-timePCR对这5个棉花中新发现的基因进行了时空表达研究，建立了各基因的时空表达模型。结果发现除GhPsbP基因由于是棉花PSⅡOEC的外周蛋白而在叶片中特异表达以外，其它四个基因都在棉花生殖相关组织中特异表达：GhGolS基因在花药和35dpa棉纤维中特异表达，GhAPm基因在30dpa棉纤维中呈优势表达，未知基因在花药中的表达量最高，GhNeuF基因在花药和25dpa棉纤维中的表达量最高。结合以前arf1和nodulin-like基因在棉花生殖器官中特异表达的研究结果，证实了该区域所存在的由7个基因组成的紧密功能基因簇正如前面所推论的那样与棉花生殖发育相关。 通过反转录PCR克隆得到了GhGolS和GhAPm的cDNA，其全长分别为1816和1590bp。GhGolS前面的基因结构预测结果除了错将一段90bp的外显子预测为内含子外，其结果与GhGolS的cDNA基本一致，GhAPm的基因结构预测结果则和其cDNA克隆完全一致。 针对GhGolS和未知基因构建了过表达载体，构建了沉默棉花GhGolS和未知基因的RNAi载体，构建了沉默拟南芥AtGolS2和中性β-呋喃果糖苷酶基因的RNAi载体，构建了同时沉默拟南芥针AtGolS2、AP复合体μ亚基基因和中性β-呋喃果糖苷酶基因的RNAi载体，将其分别转化棉花和拟南芥，获得了拟南芥的T1代转基因植株的种子，而针对T0代转基因棉花的筛选也在进行。各类转基因植株的获得为对该基因簇进行深入研究，了解其在棉花生殖发育过程中所起的作用，奠定了良好的基础。 本论文发现了一段与棉花生殖发育相关的功能基因簇，该基因簇包含了7个基因且相互间紧密连锁，对其进行了一定的研究，为今后进一步深入研究棉花生殖发育的相关机理奠定了基础，也可能会为将来高产优质棉花的培育提供新的理论基础和解决方案。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略表

声明

第一章 前言

1.1研究目的和意义

1.2国内外研究现状

1.2.1棉花生殖发育的分子生物学研究

1.2.2肌醇半乳糖苷合酶的研究

1.2.3网格蛋白关联接头蛋白(Clarthrin-associated adaptor protein，AP)复合体的研究

1.2.4 PsbP基因的研究

1.2.5 β呋喃果糖苷酶的研究

1.3本研究的研究内容和策略

第二章 包含arf1和nodulin-like BAC克隆的筛选和全序列测序

2.1材料

2.1.1 BAC文库

2.1.2试剂

2.1.3菌株

2.1.4载体及其特征

2.1.5 PCR扩增引物

2.2方法

2.2.1 PCR池筛法筛选BAC文库的基本原理

2.2.2 LB培养基

2.2.3 BAC文库混合池的构建

2.2.4.质粒DNA的小量提取

2.2.5棉花基因组DNA的提取

2.2.6 PCR反应

2.2.7目的DNA片段的电泳回收

2.2.8连接

2.2.9大肠杆菌感受态细胞的制备

2.2.10质粒DNA转化大肠杆菌

2.2.11 BAC阳性克隆插入片段大小的鉴定

2.2.12 BAC阳性克隆插入片段的全序列测序

2.3结果与分析

2.3.1 BAC文库混合池的构建

2.3.2包含arf1和nodulin-like BAC阳性克隆的筛选

2.3.3 G2-J-15和G128-K-15 BAC阳性克隆插入片段长度的鉴定

2.3.4 G2-J-15 BAC阳性克隆插入片段的全序列测序

2.4小结

第三章 G2-J-15 BAC克隆插入片段的生物信息学分析

3.1方法

3.1.1序列中基因及其结构的预测

3.1.2序列中各基因的ORF BLAST

3.1.3各基因编码的氨基酸序列的分析

3.1.4蛋白质结构及功能预测

3.2结果与分析

3.2.1序列中新基因结构、cDNA及编码蛋白的预测结果

3.2.2各基因编码蛋白的基本性质、序列比对、分析和系统进化树的构建

3.2.3各蛋白序列在TAIR中的BLAST

3.2.4各蛋白序列的疏水结构及信号肽预测分析

3.2.5蛋白质结构及功能预测结果

3.3小结

第四章 各基因的时空表达研究

4.1材料

4.1.1植物材料

4.1.2试剂

4.1.3实时荧光定量PCR(Real-time PCR)扩增引物

4.2方法

4.2.1 RNA提取前仪器及耗材的预处理

4.2.2试剂的准备

4.2.3提取棉花RNA的热硼酸方法(吴巧雯，2007)

4.2.4植物RNAout提取棉花RNA

4.2.5 RNA反转录

4.2.6反转录PCR

4.2.7 Real-time PCR

4.3结果与分析

4.3.1热硼酸法提取棉花RNA

4.3.2反转录PCR及Real-time PCR熔解曲线分析

4.3.3各基因的时空表达模型

4.4小结

第五章 GhGolS和GhAPm的cDNA克隆

5.1材料

5.1.1植物材料

5.1.2试剂

5.1.3菌株

5.1.4载体及其特征

5.1.5相关引物

5.2方法

5.2.1仪器及耗材的预处理(详见4.2.1)

5.2.2试剂的准备(详见4.2.2)

5.2.3提取棉花RNA的热硼酸方法(详见4.2.3)

5.2.4 RNA反转录(详见4.2.5)

5.2.5 PCR

5.2.6目的DNA片段的电泳回收(详见2.2.6)

5.2.7 GATEWAY克隆体系BP重组反应

5.2.8质粒DNA转化大肠杆菌(详见2.2.9)

5.2.9质粒DNA的小量提取(详见2.2.4)

5.3结果与分析

5.3.1 RNA的提取和反转录

5.3.2 PCR

5.3.3 PCR产物同收、BP重组反应、转化、测序和序列拼接

5.4小结

第六章相关基因过表达载体、RNAi载体的构建、转化

6.1材料

6.1.1植物材料

6.1.2试剂

6.1.3菌株

6.1.4载体及其特征

6.1.5 PCR扩增引物

6.2方法

6.2.1 PCR扩增

6.2.2 PCR及酶切产物回收

6.2.3质粒DNA的小最提取(详见2.2.4)

6.2.4 BamH Ⅰ和Sac Ⅰ双酶切反应

6.2.5连接(详见2.2.7)

6.2.6 GATEWAY克隆

6.2.7大肠杆菌感受态细胞的制备(详见2.2.8)

6.2.8根癌农杆菌LBA4404感受态的制备

6.2.9根癌农杆菌LBA4404的转化

6.2.10质粒的大量提取

6.2.11花粉管通道法转化棉花

6.2.12拟南芥的种植

6.2.13根瘤农杆菌LB4404转化拟南芥

6.2.14转基因植株的Kana筛选

6.2.15转基因植株的BASTA筛选

6.2.16 DNA提取(详见2.2.5)

6.3结果与分析

6.3.1 PCR反应

6.3.2相关载体的构建和鉴定

6.3.3拟南芥和棉花的转化

6.4小结

第七章全文结论

7.1阳性BAC克隆的筛选、鉴定、全序列测序和生物信息学分析

7.1.1包含arf1和nodulin-like基因阳性BAC克隆的筛选、鉴定

7.1.2 G2-J-15 BAC克隆全序列测序及生物信息学分析

7.2各基因的时空表达研究

7.3 GhGolS和GhAPm的cDNA克隆

7.4相关基因过表达载体、RNAi载体的构建、转化

7.5创新点

参考文献

致 谢

作者简历