赤红球菌OA1多环芳烃降解酶系基因簇结构和功能初探

摘要

多环芳烃(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, PAHs)是一类广泛分布的有机污染物,其对生态系统毒性大,自然条件下难降解。如何清除此类污染物是全球最关注的问题之一,并且多种具有降解和转化PAHs功能的微生物已成为全球研究热点。在实验室前期研究中分离得到一株既能高效降解多环芳烃又能高效降解苯甲酸的赤红球菌菌株OA1,本实验对赤红球菌OA1多环芳烃降解基因簇的结构和功能等进行了初步研究,为利用该类细菌资源预防、监测和控制环境多环芳烃污染及生态恢复提供理论依据和技术支持。
　　利用赤红球菌OA1作为实验菌株,用溶菌酶和酚/氯仿抽提法从菌体中提取高质量全基因组DNA,经过随机机械剪切、T4 DNA聚合酶和T4多核苷酸激酶末端修复,电泳检测并回收40kb左右的片段,利用Fast-Link? DNA Ligase连接酶使之与CopyControl pCC2FOS载体连接,再经MaxPlax? Lambda Packaging Extracts体外包装形成噬菌体,之后再转染E.coli EPI300-T1R宿主菌,成功构建了滴度为1x104 CFU/ml的赤红球菌OA1 Fosmid基因组文库。
　　以NCBI数据库中已报道PAHs生物降解菌的环羟化双加氧酶(ring-hydroxylating dioxygenase, RHD)基因的序列为基础,利用Primer Premier5.0软件设计引物,以赤红球菌OA1的基因组DNA为模板,扩增获得约为300bp的RHD基因的核心片段。利用DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I试剂盒将PCR获得的OA1-RHD标记为探针,并以此作为靶基因在构建的基因组文库中通过菌落原位杂交筛选含有多环芳烃降解基因簇的阳性克隆,结果获得两个阳性克隆子。
　　对获得的阳性克隆子抽提质粒送样测序,并对获得的DNA序列进行基因结构分析和功能预测,进而找到多环芳烃降解过程中游途径的原儿茶酸降解基因簇,其中3,4-双加氧酶(P34D)编码基因在该基因簇中占重要位置。根据P34D的全基因序列设计特异性引物,经 PCR扩增后连接到含有 T7启动子的高效表达载体 pET-30a(+)上,并转化到宿主菌E. coliBL21( DE3)中,成功筛选出P34D的高效表达重组菌株。通过对重组菌诱导表达条件的优化,实现了P34D融合蛋白的高效表达,酶活检测显示异源表达的P34D对原儿茶酸有催化降解的作用。实验结果表明,所发现的基因簇为原儿茶酸降解基因簇,赤红球菌OA1具有经原儿茶酸代谢途径使芳族化合物降解的遗传基础。

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第一章 绪 论

1. PAHs的危害及污染环境的生物修复

2. PAHs降解的分子生物学研究

3. 国内外研究现状及发展动态分析

4. 本论文研究的主要意义

5. 本论文的主要研究内容和方法

6. 技术路线

第二章 赤红球菌OA1基因组文库的构建

1. 材料和方法

2. 结果与分析

3. 小结

第三章 DIG-RHD探针标记和菌落原位杂交

1. 材料和方法

2. 结果与分析

3. 小结

第四章 Fosmid质粒提取和生物信息学分析

1. 材料和方法

2. 结果与分析

3. 小结

第五章 P34D基因原核表达体系的构建

1.材料和方法

2.结果与分析

3. 小结

第六章 P34D基因的异源表达与酶活检测

1. 材料和方法

2. 结果与分析

3. 小结

结论

本研究的创新点

参考文献

致谢

在学期间公开发表论文及著作情况

在学期间参加的课题项目

附录