粘帚霉菌寄生核盘菌菌核相关酶类的活性分析及其cDNA消减文库的构建

摘要

粘帚霉(Gliocladiumspp.)是一类重要的菌寄生菌，可寄生包括核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)在内的多种植物病原真菌，具有较大的生防潜力。本文对粘帚霉寄生核盘菌菌核的能力、其代谢产物的抑菌作用与细胞壁降解酶的关系、寄生后差异表达基因等方面进行了研究，为深入了解粘帚霉寄生核盘菌菌核的作用机理及其开发利用奠定基础。 选取本实验室分离保存的17株粘帚霉接种到核盘菌菌核上，分析其寄生能力、代谢产物的抗菌活性、几丁质酶及葡聚糖酶活性。结果表明，HL-1-1、GZH-1-1及SYP-1-1寄生核盘菌菌核的能力最强，均达到四级水平；HL-1-1代谢产物对核盘菌菌丝的抑菌作用最强，且其葡聚糖酶活性最高；SHW-1-1代谢产物中几丁质酶活性最高。通过对供试17株粘帚霉的所测指标作统计分析表明，粘帚霉寄生核盘菌菌核的能力与其代谢产物的抑菌率及几丁质酶、葡聚糖酶的活性无显著相关性，其抑菌率与几丁质酶及葡聚糖酶的活性也无显著相关性。选取对核盘菌菌核寄生能力较强的粘帚霉HL-1-1，分析其对核盘菌菌核粉的降解程度与几丁质酶、葡聚糖酶活性的关系，结果表明，粘帚霉HL-1-1核盘菌菌核粉的降解程度与葡聚糖酶的活性高度相关，且达极显著水平，但与几丁质酶活性并无显著相关。因此，在粘帚霉菌株寄生核盘菌菌核过程中，几丁质酶与葡聚糖酶对于不同粘帚霉菌株寄生过程中发挥的作用不同，其他一些物质在寄生和对核盘菌菌丝生长的抑制作用中可能发挥着重要作用。 为获得更多与粘帚霉寄生核盘菌菌核的相关基因，将粘帚霉HL-1-1寄生核盘菌菌核后的cDNA经RasI有效酶切后为Tester，纯培养的粘帚霉HL-1-1与核盘菌菌核的cDNA分别经RasI有效酶切后混合作为Driver，应用抑制消减杂交技术构建了粘帚霉HL-1-1cDNA消减文库。通过PCR技术从文库中共筛选到1315个阳性克隆，克隆中插入片段大小主要集中于300～600bp之间。随机挑取120个克隆，经测序和同源性分析，获得60条有效序列，其中一些序列所编码的血红素加氧酶、核糖体蛋白L11、细胞色素P450及热激蛋白等都参与机体对胁迫条件的应答反应。11条序列在NCBI数据库中未找到显著匹配的序列，可能为新基因片断。分别将Tester和Driver进行标记作为探针，利用反向Northern杂交技术验证了所选取的25条序列全部为寄生后的差异表达基因片段。

目录

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声明

第一章文献综述

1核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum （Lib）de bary）及其生物防治研究进展

1.1核盘菌的寄主范围及危害

1.2核盘菌的生物防治

2菌寄生菌及其作用机制的研究进展

2.1菌寄生菌

2.2菌寄生菌作用机制的研究

3常用差异基因筛选方法

3.1表达序列标签(Expressed Sequence Tag,EST)技术

3.2 mRNA差异显示(mRNA Differential Display,DD)技术

3.3代表性差异分析法(Representational difference analysis,RDA)

3.4 DNA微阵列技术(DNA microarray)

3.5抑制消减杂交技术(Suppression Subtractive Hybridization,SSH)

4本研究的目的及意义

第二章 粘帚霉菌寄生核盘菌菌核的能力及其代谢产物分析

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果与分析

2.1粘帚霉对核盘菌菌核寄生能力的比较与分析

2.2粘帚霉寄生大豆核盘菌菌核代谢产物分析

2.3不同粘帚霉菌株寄生能力、代谢产物抑菌活性、代谢产物中几丁质酶及葡聚糖酶活性之间的相关分析

2.4培养时间对粘帚霉HL-1-1代谢产物中细胞壁降解酶活性的影响

3本章小结

第三章 应用SSH技术构建粘帚霉HL-1-1寄生核盘菌菌核前后CDNA消减文库

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果与分析

2.1总RNA及mRNA的检测

2.2消化效率检测

2.3连接效率分析

2.4抑制性PCR分析消减杂交效率

2.5 PCR法初步筛选重组质粒

2.6差异表达片断的序列测定及其同源性分析

第四章反式NORTHERN杂交检测CDNA消减文库有效性

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果与分析

第五章 讨论

1关于细胞壁降解酶类

2关于粘帚霉HL-1-1寄生核盘菌菌核cDNA消减文库

结论

参考文献

附录

致谢

作者简历