高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒与猪圆环病毒2型共感染协同致病性的研究

摘要

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(Highly pathogenic porcine reproductive and respiratorysyndrome virus,HP-PRRSV),是由PRRSV在NSP2基因(Nonstructural protein2)上缺失90个核苷酸形成的突变株。能够引起不同生长阶段猪高热、高发病率和高死亡率,给我国养猪业造成巨大经济损失。猪圆环病毒2型(Porcine cirovirus type2,PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)的主要病原。近年来,国内外有关PRRSV与PCV2共感染报告较多,引起广泛关注。鉴于我国猪群中HP-PRRSV和PCV2共感染现象相当严重,掌握两种病毒的变异情况,深入了解这两种病毒的协同致病作用十分重要。本研究对两种病毒共感染进行了流行病学调查,对其流行毒株进行了遗传变异分析,并通过用两种病毒不同时间顺序感染猪试验建立了共感染动物模型,为我国HP-PRRSV和PCV2的综合防制提供科学依据。
　　 为掌握HP-PRRSV的变异情况,揭示该病的发生规律,本研究采用RT-PCR法对2005～2010年间送检的282份病料进行了PRRSV核酸检测,对其中9份阳性样品进行了ORF5～7基因片段扩增和测序,所得序列与GenBank下载的PRRSV CH-1a、VR2332、HB-2、LV株的ORF5序列进行相似性比较,并与国内已发表的27株PRRSV ORF5序列进行了遗传进化树分析:此外,对GP5蛋白潜在糖基化位点与数目进行了预测与分析。结果表明,9个流行毒株同属于一个基因亚群,其ORF5序列相似性为95.0％～99.2％,氨基酸序列相似性为92.0％～99.0％；与4个参考毒株的ORF5序列相似性依次为93.4％～95.5％、87.6％～89.4％、91.2％～92.7％、63.0％～64.0％,氨基酸序列的相似性依次为91.0％～94.0％、85.6％～88.6％、89.6％～92.0％、54.7％～58.2％;GP5糖基化位点分析:存在5个糖基化位点有3株,4个糖基化位点有5株,3个糖基化位点有1株；这些糖基化位点分布在第30～55位氨基酸之间,以第44、55位点保守,另3个位点存在变异。我国猪群中HP-PRRSV流行毒株变异幅度较大,GP5糖基化位点不同可能与毒力存在一定联系。
　　 根据GenBank登录的PRRSV和PCV2基因序列设计引物,采用RT-PCR和PCR法对2005～2010年间送检的282份病料进行了HP-PRRSV和PCV2核酸检测,旨在了解HP-PRRSV和PCV2的在猪群中的共同感染情况。结果表明,病料PRRSV核酸阳性检出率为18.8％,PCV2核酸阳性检出率为35.3％(101／282),PRRSV和PCV2共感染核酸阳性检出率为10.7％,我国猪群中PRRSV和PCV2共感染现象较为普遍。
　　 为阐明HP-PRRSV和PCV2的协同致病作用,澄清两种病毒不同时间顺序共感染与其协同致病力之间的关系。选取35日龄阴性健康猪30头,随机分6组,PCV2／HP—PRRSV顺序共感染组、HP-PRRSV／PCV2顺序共感染组、HP-PRRSV+PCV2同时共感染组、HP-PRRSV感染组、PCV2感染组、未接种对照组。感染后每天测量体温、观察临床症状,每周称量体重、采血。用流式细胞仪检测血液中的CD3+CD4+CD8-、CD3+CD4-CD8+、γδT、NK细胞及粒细胞和单核细胞变化；免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)检测这两种病毒抗体变化；用ELISA法检测血清中IFN-γ、TNF-α、IL-10、IL-2、GM-CSF细胞因子变化；用荧光定量PCR法检测血清和组织中病毒载量。对各组试验猪进行组织病理学观察。试验结果表明,HP-PRRSV／PCV2顺序共感染组临床症状最严重,死亡率达60％；组织和血清中病毒载量显著高于其它组,抗体滴度明显低于其它组；淋巴细胞亚群及细胞因子(尤以TNF-α)变化也最为明显。临床猪群中HP-PRRSV和PCV2普遍存在共感染,猪群感染HP-PRRSV后再感染PCV2,可明显提高猪群发病率和死亡率。无论从宏观还是微观水平,这两种病毒协调感染均能显著促进在猪体的病毒复制,进而导致更严重的临床症状和病理损伤。本研究为深入探讨这两病毒的协同致病机制奠定了基础,也为临床遇到的PRRSV与PCV2混合感染引起的疫病防控提供了科学依据。