LIM转录因子(Oslim)参与水稻非寄主抗性的功能分析

摘要

转录因子参与调节信号转导、抗逆反应、防卫反应等生物学过程,是调控一系列基因表达的重要因子。LIM转录因子是指含有LIM结构域的转录因子,在高等生物中广泛存在,参与基因转录、信号传导和细胞骨架建成等生物学过程。
　　 为了研究LIM转录因子在水稻非寄主抗性中的作用,本论文以水稻品种日本晴为材料,根据LIM转录因子编码基因Oslim(LOC_Os03g42820)的序列,利用特异性引物克隆了Oslim片段,并构建了该基因的RNA干扰载体；通过农杆菌介导法转化水稻,获得了转基因水稻植株；利用PCR检测和GUS染色检测选择出转基因阳性植株,并利用荧光定量PCR检测转基因阳性植株中Oslim的表达水平；最后,对转基因阳性植株接种非寄主菌(辣椒斑点病菌,Xanthomonas campestris pv.vesicatoria),进行抗病性鉴定,分析Oslim的功能。本实验的主要结果如下:
　　 (1)Oslim片段的克隆。以水稻品种日本晴叶片cDNA为模板,利用设计的特异性引物,克隆得到了Oslim片段并测序,将测得的序列与水稻转录因子数据库中的该基因序列(LOC_Os03g42820)进行序列比对,发现二者的相似性达到了98％,表明己成功克隆Oslim片段。
　　 (2)RNA干扰载体的构建。将克隆的Oslim片段正向、反向连入pTCK303干扰载体,获得了Oslim的RNA干扰载体。通过酶切验证,证实了Oslim的RNA干扰载体构建成功。
　　 (3)Oslim沉默的转基因水稻植株的获得。利用农杆菌介导法,将Oslim的RNA干扰载体转入水稻愈伤组织基因组中。通过组织培养,获得了15株Oslim沉默的转基因水稻植株。通过PCR检测和GUS染色法检测,发现其中的13株为转基因阳性植株。通过荧光定量PCR检测,发现转基因阳性植株中Oslim的表达水平显著降低。
　　 (4)转录因子Oslim在植物防卫反应中的功能分析。对转基因阳性水稻接种非寄主菌(辣椒斑点病菌,Xanthomonas campestris pv.vesicatoria),以野生型水稻作对照。接种20天后调查发病情况,发现野生型水稻不发病,而Oslim沉默的转基因水稻发病严重,说明Oslim沉默后,水稻对非寄主菌的抗性丧失,即丧失了非寄主抗性。