烃类厌氧降解过程中互营细菌的分布特征和系统发育研究

摘要

本研究以石油烃厌氧降解产甲烷条件下730天的厌氧富集物为接种源,以丁酸盐或乙酸盐为唯一碳源,通过添加或不添加外源产甲烷古菌的方式在实验室条件下模拟乙酸盐、丁酸盐产甲烷条件下互营降解的生物学过程。采用显微观察、气相色谱及离子色谱检测、PCR-DGGE变性梯度凝胶电泳、qPCR等多种技术手段,检测富集样品在不同条件下、不同代次间菌群的生长状况及群落结构变化。同时,本课题还对两株分别分离自油污土和油藏采出液的厌氧纯培养物进行了形态学观察、生理生化鉴定和系统发育学研究。
　　 研究结果如下:(1)从生理生化特性,显微观察及RCR-DGGE实验结果得知乙酸及丁酸互营富集体系富集成功,这将推动难降解化合物降解机制的研究,同时这是国内首次利用石油烃厌氧降解富集物为接种源构建的厌氧互营丁酸、乙酸富集体系；(2)具有互营代谢能力的细菌存在于互营共聚体中,互营共聚体在不同富集条件、不同代次间群落结构差异较大；(3)显微观察结果显示,互营共聚体中同时存在产甲烷古菌和发酵性细菌,MA、MB、SⅠ、SⅢ四种共聚体经不断传代(传至第四代)产甲烷古菌和发酵性细菌形成各自特有的共聚体结构；(4)60℃产甲烷条件下的共培养物对乙酸盐的降解速率要大于对丁酸盐的降解速率,添加外源产甲烷古菌的互营丁酸盐富集培养物经不断传代后缩短了丁酸盐降解的启动时间,增强了其产甲烷的能力,但互营乙酸盐富集培养物的实验结果与之相反,未添加外源产甲烷古菌的富集培养物对乙酸盐的降解速率比添加外源产甲烷古菌的富集培养物降解速率要快,这可能与产甲烷古菌与发酵性细菌形成的聚集体结构有关；特定互营富集培养物降解特定酸所需时间较长,这一实验现象与互营共聚体生长代谢缓慢的特性相吻合；(5)菌株xyl-d分离自胜利油田油层采出液,经鉴定为嗜热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter),耐酸(pH生长范围为3.0-10.0)、嗜热(最适生长温度为65℃)、高效降解D-木糖(最适菌体生长条件下对D-木糖的降解率为91.37％),产物以乙醇为主,且副产物较少(最适生长条件下乙醇／乙酸摩尔量之比为46:1),这为构建高产乙醇的工程菌株提供了菌种资源；(6)菌株MH5分离自胜利油田石油烃污染土壤,经鉴定为紫单胞菌科(Porphyromonadaceae)的新种,与Proteiniphilum acetatigenesT16S rRNA序列相似性最高,为94.0％。这是国内首次从油藏中获得Proteiniphilum的新种。对xyl-d和MH5的研究不仅为我们认识油藏微生物菌群构成提供了新的理论依据,而且也为我国油藏微生物资源库提供了新的资源。