通过二次抑制差减杂交方法克隆和鉴定大豆耐盐相关基因

摘要

大豆是世界上重要的粮食作物,又是我国主要的油料作物。大豆属于中度耐盐植物,受盐渍条件影响显著,在盐渍条件下产量下降明显。我国是盐碱化土地分布广泛的国家之一,且由于灌溉不当、植被破坏和海水入侵等因素,致使土地盐渍化的面积每年还在不断增加。因此,培育耐盐品种显得尤为迫切。抑制差减杂交技术是一个研究基因差异表达的有效方法,而且在多数植物中都有成功应用的例子。但是,在筛选文库时会得到大量的EST序列,获得的有效基因数目较少,筛选的效率较低。尽管与耐盐机理相关的信息比较丰富,但是耐盐机理的基础理论研究还不够深入。为了更好的理解大豆盐胁迫反应的分子机理和克隆一些大豆中重要的耐盐基因。
　　 本研究利用大豆耐盐品种文丰7号和盐敏感品种Union,分别构建了耐盐大豆品种根系盐诱导表达的抑制差减文库(SSH1)和盐敏感大豆品种根系盐诱导表达的抑制差减文库(SSH2)。利用文库SSH1和SSH2的二次PCR产物,经过再一次的抑制差减杂交,构建了抑制差减文库SSH3。在三个文库中分别随机挑取了600个阳性克隆子,经过测序共获得高质量的EST序列1500个,513个来自SSH1,453个来自SSH2,534个来自SSH3。并提交到GenBank的dbEST数据库中,获得序列号为HO759947-HO761446。
　　 经过序列比对分析,挑选了16个可能与耐盐性相关的基因。利用Real—time PCR方法分析它们在不同大豆品种盐处理前后的差异表达情况。结果表明,这些基因在文丰7与Union盐处理前后中的表达存在差异。
　　 对文库SSH1和SSH2中相同和相似的EST序列进行了Dot blot杂交检测。杂交的结果表明,文库SSH3确实可以将SSH1和SSH2中相似的EST序列剔除掉。对文库SSH1和SSH3中获得的EST序列进行了GO基因的功能注释和COG功能分类分析。结果证明,文库SSH3可以将一些与生长发育和防御机制相关的基因剔除掉。因此,文库SSH3确实使耐盐相关的基因得到了富集,而且提高了筛选的效率。
　　 从与大豆耐盐性高度相关的EST序列中确定并选择了2个候选基因。通过与NCBI中的EST数据库进行比对分析,预测和克隆了两个基因。生物信息学分析发现,它们分别与硫氧还蛋白和耐钠、锂离子基因同源性很高,分别被命名为GmTrx和GmSLT。而且前人研究发现,这两类基因与提高植物的耐盐性相关。构建了GmSLT基因根系转化正、反义和缺失的表达载体,利用大豆根系转化系统研究了这个基因与耐盐性的关系。试验结果表明,GmSLT基因的过表达在一定程度上提高了大豆转基因发状根和大豆复合体植株的耐盐性。