棉花航天诱变芽黄突变体SSH文库的构建及差异表达基因分析

摘要

棉花芽黄突变体在自然界中广泛存在,从1925年第一次发现至今,已经鉴定出了22个芽黄突变体,涉及26个芽黄突变基因。本实验窒从棉花早熟品种中棉所58的航天诱变后代中发现了一新的芽黄突变体,其黄化现象从第一片真叶长出后开始,至盛花期结束。具体性状表现为:子叶绿色,真叶刚长出时为黄色,3天时(倒2位叶片)黄化最严重,10天后(倒5位叶片)变绿,如此循环,直至盛花期结束,且果枝上的幼嫩叶片也是黄色的。以往对芽黄突变体的研究大多停留在遗传规律上,对于其产生的分子机制仍不清楚。本实验通过构建突变体倒2叶／突变体倒5叶正反消减文库、突变体倒2叶／野生型倒2叶正反消减文库,筛选芽黄突变体中的差异表达基因,以期从分子水平上了解芽黄突变体产生的原因。本研究取得的主要结果如下:
　　 1.利用快速叶绿素荧光诱导动力学测定和JIP-test数据分析方法,研究了晴天条件下野生型和突变体不同叶位叶片(倒1叶、倒2叶、倒3叶、倒4叶、倒5叶)的原初光化学反应的变化。野生型植株的叶片从倒1叶至倒5叶其Fv／Fm和PIABA值呈递增的变化趋势,而突变体植株的倒2位叶片的Fv／Fm和PIABS值最低,之后逐渐增加,至倒5叶时与野生型的相比无显著性差异。野生型植株不同叶位叶片的Wk值呈递减的变化趋势,突变体植株的幼嫩叶片(倒1叶和倒2叶)Wk值较高,之后下降,表明突变体幼嫩叶片放氧复合体受到损害。通过对参数MO、Sm、ΦEo、ψO。的分析发现,突变体叶片发育早期PSⅡ受体侧的QA-大量积累,电子传递链受阻。而参数ABS／RC、TRO／RC、ETO／RC、DIO／RC等的变化则表明突变体单位反应中心吸收的较多的能量以热和荧光的形式被耗散掉。
　　 2.成功构建了4个消减文库,共挑选了4032个单克隆,去冗余拼接后得到2459条Unigenes。通过Blastn和Blastx后,部分序列涉及叶绿素合成、叶绿体发育、光合机构建成等代谢途径。从中挑选了14个相关基因进行qRT-PCR验证,与野生型相比,突变体黄化叶片中PEP转录的质体编码的光合相关基因(PetB、PsbH、psbC和psbD等)表达量降低,NEP转录的编码转录／翻译的器官的基因(rpoA和rpoB)表达量升高,表明突变体黄化叶片中质体转录物的翻译效率低或者质体蛋白易降解。