马流感病毒抗原捕捉ELISA检测方法的建立及其初步应用

摘要

马流感是由马流感病毒(Equine influenza virus,EIV)引起马属动物的一种急性呼吸性传染病,具有国际传播性、高度传染性、发病频率高、发病率不稳定和死亡率低等特点。随着北京奥运会和广州亚运会马术比赛的成功举办,赛马运动在我国逐渐发展为一种异军突起的新兴产业。同时我国又有着丰富的马驴产业,因此马流感防控工作任重而道远,建立一种快速、可靠、适于基层使用的EIV诊断方法对于马流感防治十分必要。
　　 本研究以实验室保存的EIV A／马／新疆／07(H3N8)(简称XJ株)为基础毒株,通过RT-PCR方法,扩增出NP基因并克隆至pMD-18T载体。测序鉴定正确后,通过双酶切将NP基因亚克隆至原核表达载体pET-30a,构建重组质粒pET30a-NP并转化Rosetta(DE3)。通过对表达条件的优化,最终获得分子质量约64ku、可溶性形式的重组蛋白NP,并采用镍柱对该蛋白进行纯化。Western blot检测结果表明,重组蛋白NP及纯化NP均能与马流感阳性血清发生特异性反应,具有良好的抗原性。
　　 将纯化NP作为免疫原,腹腔接种4周龄BALB／c小鼠。按照常规杂交瘤细胞融合技术将免疫小鼠脾细胞与SP2／0融合。用蔗糖密度梯度纯化的XJ株为筛选抗原,建立间接ELISA方法,筛选出针对NP单克隆抗体的杂交瘤细胞。最终获得三株能够稳定分泌NP单克隆抗体的杂交瘤细胞株(2G11、3E10和4A1)。Western blot、间接免疫荧光和间接ELISA结果表明三株单克隆抗体均能特异性识别重组蛋白NP,与天然EIV结合,而与His标签蛋白和马日本脑炎病毒、马疱疹病毒1／4型及马动脉炎病毒均不发生反应。
　　 用蔗糖密度梯度纯化的XJ株和纯化NP为免疫原接种家兔,分别制备针对EIV XJ株的多克隆抗体(简称抗EIV多抗)和抗NP多克隆抗体(简称抗NP多抗)。选取单克隆抗体2G11分别与抗EIV多抗和抗NP多抗建立四种抗原捕捉ELISA方法,即以抗EIV多抗为捕获抗体,2G11为检测抗体的抗原捕捉ELISA1；以2G11为捕获抗体,抗EIV多抗为检测抗体的抗原捕捉ELISA2以2G11为捕获抗体,抗NP多抗为检测抗体的抗原捕捉ELISA3和以抗NP多抗为捕获抗体,2G11为检测抗体的抗原捕捉ELISA4。将优化的四种方法分别与马疱疹病毒1／4型、马乙型脑炎病毒和马动脉炎病毒进行交叉反应试验,均不发生反应,具有较高的特异性。四种抗原捕捉ELISA方法均与H7N7亚型EIV有交叉反应,且敏感性明显高于血凝试验结果。尤其是第4种方法,对禽源性A／马／吉林／89(H3N8)(简称JL株)、欧洲系A／马／青海／94(H3N8)(简称QH株)和A／马／迈阿密／63(H3N8)(简称Miami株)都具有很高的敏感性。
　　 采用喷雾法对无EIV抗体的幼驹进行攻毒试验。攻毒后连续10d采集鼻拭子,同时进行病毒分离、多重RT-PCR和上述四种抗原捕捉ELISA。试验结果表明,第4种抗原捕捉ELISA与病毒分离和多重RT-PCR符合性最好,可检测到攻毒后第3-7d的病毒粒子。初步证明其适于EIV的临床检测。总之,该诊断技术的建立填补了其在我国马流感病原学诊断中的空白,为马流感的快速确诊提供了有效工具。