PMI筛选体系的建立及MHA-MLTB融合基因在百脉根中的表达

摘要

广泛应用于植物遗传转化的抗生素和除草剂选择标记对环境生态和人类健康可能具有潜在风险,因此生物安全筛选标记已成为当前植物转基因研究的热点。磷酸甘露糖异构酶基因(phosphomannose isomerase,PMI)是一种新型生物安全选择标记基因,该广泛存在于植物之外的生物界,但在植物中只有肉桂和大豆等存在。
　　 全球肆虐的禽流感不但给家禽养殖业造成了重大经济损失,同时也已严重威胁着人类健康。禽流感血凝素是主要的抗原蛋白。大肠杆菌不耐热毒素B亚基(LTB)能刺激肠道上皮细胞,增强黏膜细胞对抗原通透性,从而增强免疫反应。本实验以构建禽流感血凝素MHA基因和大肠杆菌热敏毒素B亚基基因MLTB融合表达载体,并以PMI作为筛选标记,添加MAR表达调控元件,转化百脉根,通过PCR、RT-PCR以及Southern-blotting检测获得转基因植株。主要研究结果如下:
　　 1.设计了27种不同甘露糖和蔗糖浓度配比,观察百脉根外植体在不同浓度梯度培养基中分化的情况,以测定外植体对甘露糖的耐受浓度。将外植体置于不同甘露糖浓度的MS培养基中培养30d后,测定不同浓度梯度下的外植体鲜重和出芽率。在同一蔗糖浓度下,随着甘露糖浓度的升高,外植体鲜重呈递减趋势,同时外植体分化率大幅下降,出芽数量减少,芽也因受抑制生长发育迟缓；当甘露糖浓度达到20g／L之后,外植体的鲜重平均下降了80％,且外植体已不再分化,并逐渐黄化枯死。将百脉根种子置于不同甘露糖浓度的培养基中,2周后发现随着甘露糖浓度的增加,发芽率逐渐降低,生根受到抑制,根系变短；当甘露糖浓度达到15g／L之后,生根完全受到抑制。依据上述研究数据确定筛选浓度,从而建立了PMI筛选体系。
　　 2.在载体pCAMBIA1302基础上,设计特异引物,从pNOV2804上扩增PMI基因,利用基因重组技术,将pCAMBIA1302的Hygromycin基因替换为PMI基因,构建了以PMI为筛选标记的植物表达载体pCAMBIA1302-PMI。并将其以农杆菌介导法转化百脉根,通过PCR、RT-PCR及Southern-blotting检测获得转基因植株,并对转基因植株进行了酶活测定,以PMI怍为筛选标记获得转化率为23％。结果表明PMI筛选标记可代替传统的抗生素抗性标记并成功应用于百脉根,在国内外尚属首例。
　　 3.在载体pCAMBIA1302-PMI基础上,设计特异引物,分别通过PCR扩增得到经过人工改造的禽流感血凝素MHA基因和大肠杆菌热敏毒素B亚基基因MLTB,利用基因重组技术,构建了以PMI为筛选标记的植物高效融合表达载体pCAMBIA1302-PMI-MHA—MLTB-MARs(植物表达载体pCAMBIA1302、PMI筛选标记、核基质结合区MAR RB7、CaMV35S启动子、MHA基因、MLTB基因、NOS终止子)。
　　 4.将载体pCAMBIA1302-PMI-MHA—MLTB—MARs通过农杆菌介导法转化百脉根子叶,对通过甘露糖筛选的抗性植株进行PCR、RT-PCR以及Southern—blotting检测,获得37株转基因植株。通过氯酚红法对获得的转基因植株进行酶活测定。结果表明,目的基因在百脉根中稳定表达。