TCP基因调控黄瓜卷须发育机理的初探

摘要

黄瓜是世界性的重要蔬菜作物之一，株型是黄瓜重要的农艺性状。卷须是影响黄瓜株型的重要组织器官。本实验室已克隆调控黄瓜卷须发育的关键基因TEN，该基因属于TCP家族中ClassⅡ的CYC/TB1亚类。TCP（TEOSINTE BRANCHED1/CYCLOIDEA/PCF1，2）转录因子是植物特有的一类转录因子，主要参与植物细胞分化和生长，在植物的生长发育、形态建成以及对外界环境的适应过程中起着重要的调控作用。目前针对这一亚类基因的直接下游基因和转录结合元件鲜有报道。
　　本研究主要是通过体外SAAB试验寻找卷须身份基因TEN的结合元件，并结合转录组数据和体内的ChIP-Seq数据来寻找TEN的下游候选基因，即参与黄瓜卷须发育的基因，初步解析卷须发育的分子机制。
　　主要结果如下:
　　1.利用公司制备的TEN抗体，对黄瓜根、茎、叶、雌花、雄花、果实、卷须的粗蛋白进行WesternBlot检测，结果表明TEN蛋白在黄瓜卷须中特异表达。
　　2.检测1～3cm嫩卷须、伸直卷须和缠绕3～5圈的卷须中TEN蛋白含量，结果显示TEN总蛋白含量从卷须幼嫩时逐渐升高，到伸直时期含量最高，到缠绕时期含量又开始降低;将黄瓜卷须中总蛋白、细胞质、细胞器和细胞核蛋白进行分离，来确定TEN蛋白在卷须细胞中分布情况，结果发现蛋白大多集中在细胞质，核中很少。
　　3.正常卷须与变态卷须的转录组数据比较发现:在变态卷须中上调的基因有1271个，与植物侧枝发育相关的基因显著富集;下调的基因有433个，与植物向触性运动相关的基因显著富集。
　　4.利用卷须材料得到ChIP-DNA进行测序，然后运用生物信息学手段进行数据处理，结果表明TEN结合的核心元件很可能是AAGAAG/A或C/TTTCTT。
　　5.诱导条件经优化后，0.1mM IPTG，22℃，180 rpm，8h条件下能得到较多可溶性的GST-TEN融合蛋白，分子量大小约为71 kDa，与预测的融合蛋白大小相符合。
　　6.体外的SAAB试验结果表明TEN的结合元件为GGNCCC和ACAC。

目录

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摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 转录因子概述

1．2 TCP转录因子家族

1．2．1 TCP转录因子特点

1．2．2 TCP转录因子的生物学功能

1．2．3 TCP转录因子的下游基因研究进展

1．3 植物卷须性状的研究近况

1．4 转录因子-DNA互作的研究手段

1．4．1 ChIP和ChIP-Seq

1．4．2 SAAB

1．5 研究目的和意义

1．5．1 研究目的

1．5．2 研究意义

第二章 材料和方法

2．1 试验材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 载体和菌株

2．1．3 酶、试剂、试剂盒

2．1．4 溶液和试剂配制

2．2 试验方法

2．2．1 正常卷须与变态卷须的转录组测序

2．2．2 蛋白系统

2．2．3 核质分离试验

2．2．4 ChIP-Seq

2．2．5 原核表达纯化系统

2．2．6 SAAB试验

第三章 试验结果和讨论

3．1 TEN蛋白在黄瓜中的表达情况

3．1．1 TEN蛋白的组织特异性

3．1．2 卷须不同时期的TEN蛋白分布

3．1．3 TEN蛋白在卷须中的亚细胞分布

3．2 正常卷须与变态卷须的转录组数据分析

3．3 ChIP-Seq数据的产生与分析

3．3．1 ChIP-Seq数据的产生

3．3．2 ChIP-Seq数据的分析

3．4 SAAB确定TEN的结合元件

3．4．1 GST-TEN原核表达载体的构建

3．4．2 GST-TEN融合蛋白的分离与纯化

3．4．2 SAAB试验推测TEN蛋白的结合元件

3．5 讨论

3．5．1 ChIP-Seq在蛋白-DNA互作研究中的应用

3．5．2 TEN调控卷须发育的功能和分子机制

第四章 结论

参考文献

附录

致谢

作者简历