伪狂犬病病毒感染诱导的小胶质细胞动态学变化的研究

摘要

猪伪狂犬病(Aujeszky's disease)最早发现于美国，在1920到1940年间呈世界性散在发生，并且在之后30年间呈爆发性，其发病率明显增加。目前，猪伪狂犬病在我国仍然是威胁养猪业的重要疾病之一。
　　伪狂犬病病毒(Pseudorabies Virus，PRV)属于疱疹病毒科病毒，为有囊膜的双链DNA病毒。PRV感染动物后可以沿着感染部位附近外周神经复制移行，逐渐进入中枢神经系统(CNS)，导致脑组织发生病变。研究伪狂犬病病毒诱导的小胶质细胞(microglia)动态变化及microglia动态变化对疾病发展进程的影响具有重要意义。本实验主要通过建立PRV人工感染小鼠模型，研究伪狂犬病病毒感染诱导的小胶质细胞动态学变化。实验采用PRV-Bartha K61疫苗株皮下人工感染小鼠，使用6×104TCID50、1×105TCID50以及2.7×105TCID50三组剂量作为人工感染剂量。三组剂量均在人工感染后6d导致小鼠出现死亡，小鼠存活率分别为93％、93％和85％。然而在人工感染后第7d，小鼠存活率差异显著，6×104 TCID50剂量实验组存活率无变化，而另外两组分别降至67％及14％。各剂量组人工感染后均导致小鼠大脑及脑干出现病变，其病变程度与人工感染剂量呈正相关。1×105TCID50剂量实验组既能使小鼠保持较高的存活率，又可导致明显的脑组织病变，所以采用其为后续实验人工感染剂量。通过免疫组织化学染色，激光共聚焦及流式细胞术分析PRV感染诱导的microglia动态变化。用增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)抗体和microglia及巨噬细胞特异性蛋白抗体Iba1(ionized calcium binding adapter molecule1)标记增殖的microglia，用Iba1免疫组化染色方法观察microglia细胞形态。结果显示，PRV感染后大脑组织中出现增殖的microglia．其形态由静息状态(Resting)转化为活化状态(Activated)。应用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-deoxy-uridine，BrdU)示踪技术，证明microglia非原位增殖。通过用G蛋白偶合受体激酶1(Gr1)抗体，抗中性粒细胞表面抗原Ly6G抗体及抗单核细胞表面抗原Ly6C抗体，经流式细胞术分析增殖microglia的表型特征，结果显示增殖microglia为CD11 b+CD45hiGrl+Ly6G-Ly6Chi，证明其来源于外周血炎症性单核细胞。通过Semi-quantitative PCR方法对PRV感染后microglia极化状态分析的结果表明，M1型标志性细胞因子诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素6(IL-6)和IL-12的表达量随着感染经过时间递增。M2型细胞因子IL-10和YM1在PRV人工感染后6-7d表达量上升，说明microglia在PRV感染后向M1及M2方向均有极化，microglia的极化状态与PRV致病性的关系有待进一步研究。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 伪狂犬病(Aujeszky’s disease)概况

1．1．1 病原学

1．1．2 分子生物学特点

1．1．3 感染特点

1．1．4 流行病学

1．1．5 临床症状

1．1．6 预防控制

1．2 小胶质细胞的形态、功能与表型变化

1．2．1 天然免疫

1．2．2 Microglia的形态和功能

1．2．3 Microglia增殖

1．2．4 Microglia极化

1．2．5 PRV感染诱导的细胞动态变化

1．3 研究目的和意义

第二章 PRV人工感染小鼠实验模型的建立

2．1 材料和方法

2．1．1 病毒株

2．1．2 实验动物

2．1．3 主要试剂与仪器

2．1．4 实验设计

2．1．5 病毒TCID50的测定

2．1．6 临床症状观察

2．1．7 病理切片的制备

2．1．8 病理组织学观察

2．1．9 免疫组织化学染色

2．1．10 数据分析

2．2 结果

2．2．1 人工感染不同剂量的PRV后小鼠存活宰

2．2．2 小鼠脑组织病理学观察

2．2．3 PRV免疫组化染色

2．3 讨论

第三章 PRV感染诱导的Microglia的增殖与活化

3．1 材料和方法

3．1．1 主要试剂和仪器

3．1．2 实验设计

3．1．3 激光共聚焦

3．1．4 免疫磁珠法提取Mieroglia

3．1．5 流式细胞术

3．1．6 数据分析

3．2 结果

3．2．1 PRV患染诱导Microglia增殖

3．2．2 PRV感染诱导Microglia活化

3．2．3 Microglia吞噬PRV粒子

3．3 讨论

第四章 PRV感染诱导的增殖Microglia来源的分析

4．1 材料和方法

4．1．1 主要试剂和仪器

4．1．2 实验设计

4．1．3 BrdU免疫组化

4．1．4 流式细胞术

4．1．5 数据统计

4．2 结果

4．2．1 BrdU免疫组化观察

4．2．2 BrdU流式细胞术检测结果

4．2．3 PRV人工感染小鼠后CD11b+Gr1+CD45hi数量增多

4．2．4 PRV人工感染小鼠后CD11b+CD45hiLy6G+细胞数量无变化

4．2．5 PRV人工感染小鼠后CD11b+CD45hiLy6Chi细胞数量显著增多

4．3 讨论

第五章 PRV感染诱导的Microglia极化状态的分析

5．1 材料和方法

5．1．1 主要试剂和仪器

5．1．2 实验设计

5．1．3 引物设计

5．1．4 M1型和M2型特异性因子mRNA表达水平的检测

5．1．5 琼脂糖凝胶电泳

5．2 结果

5．2．1 PRV人工感染后M1型细胞因子表达量升高

5．2．2 PRV人工感染后M2型细胞因子表达量呈升高趋势

5．3 讨论

第六章 全文结论

参考文献

致谢

作者简介