反枝苋对咪唑乙烟酸的靶标位点抗药性

摘要

随着化学除草剂的长期、大面积使用，我国农田杂草抗药性发展越来越严重。反枝苋(Amaranthus retroflexusL.)是我国常见杂草，广泛分布于农田、果园、荒地，反枝苋的为害可使大豆减产20％以上。咪唑乙烟酸属乙酰乳酸合成酶(ALS)抑制剂类除草剂，主要用于防除大豆田阔叶杂草，在我国大豆主产区连续使用数十年后，部分省市在推荐剂量下出现了反枝苋防治失败的情况。为明确反枝苋对咪唑乙烟酸的抗性水平及抗性机理，本研究以采自黑龙江、吉林、安徽、内蒙古、新疆五省市的12个反枝苋种群为试材，通过单剂量甄别确定采自黑龙江的3个反枝苋种群对咪唑乙烟酸产生了抗药性，并以其为材料研究了其抗药性机制。主要研究结果如下:
　　(1)单剂量甄别抗药性:与敏感性反枝苋种群13-76相比，种群13-03、13-17和12-39鲜重抑制率在20％以下，为咪唑乙烟酸抗药性种群。
　　(2)抗药性水平测定:剂量反应曲线拟合结果表明，种群13-03、13-17和12-39抗药性指数均在10以上。其中，采自黑龙江嫩江县和黑龙江嫩北农场的反枝苋种群12-39、13-17抗药性指数超过90;采自黑龙江九三山河农场的反枝苋种群13-03抗药性指数为14.51。
　　(3) ALS离体活性测定:抗药性种群ALS对咪唑乙烟酸的敏感性降低。抗药性反枝苋种群13-03和13-17对咪唑乙烟酸的抑制中浓度(I50)与敏感性种群13-76的比值分别为14.83和15.27，而与抗药性种群12-39的比值达到268。说明反枝苋体内ALS敏感性降低是抗药性产生的原因之一。
　　(4)分子检测:与敏感性反枝苋种群13-76的ALS基因序列相比，抗药性反枝苋种群13-03、13-17和12-39在ALS基因序列的保守区域发生了不同位点的突变，分别为205位GCT突变为GTT，653位AGC突变为ACC，574位TGG突变为TTG，分别导致丙氨酸被缬氨酸取代，丝氨酸被苏氨酸取代，色氨酸被亮氨酸取代。
　　综上所述，抗药性反枝苋种群体内ALS敏感性降低是其对咪唑乙烟酸产生抗药性的主要原因，而反枝苋各抗药性种群ALS基因不同位点的突变是抗药性种群体内ALS对咪唑乙烟酸敏感性降低的原因。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 前言

1．1 杂草的危害及防除现状

1．2 杂草抗药性的发生与发展

1．3 杂草对ALS抑制剂抗药性机理研究进展

1．3．1 ALS及ALS抑制剂类除草剂

1．3．2 杂草对ALS抑制剂抗药性的发生与发展

1．3．3 杂草对ALS抑制剂的抗药性机制

1．4 本文研究目的意义

第二章 不同反枝苋种群对咪唑乙烟酸的抗药性水平测定

2．1 单剂量甄别抗药性

2．1．1 试验材料

2．1．2 试验方法

2．1．3 结果与分析

2．2 测定剂量反应曲线确定抗性指数

2．2．1 试验材料

2．2．2 试验方法

2．2．3 结果与分析

第三章 不同反枝苋种群乙酰乳酸合成酶活性测定

3．1 试验材料

3．2 试验方法

3．2．1 反枝苋培养

3．2．2 蛋白标准曲线

3．2．3 3-羟基丁酮标准曲线

3．2．4 乙酰乳酸合成酶提取、纯化及脱盐

3．2．5 乙酰乳酸合成酶离体活性测定

3．2．6 数据处理

3．3 结果与分析

3．3．1 蛋白质浓度标准曲线

3．3．2 3-羟基丁酮标准曲线

3．3．3 不同反枝苋种群ALS酶活及I50测定结果

第四章 反枝苋对咪唑乙烟酸的抗药性分子基础

4．1 试验材料

4．2 试验方法

4．2．1 引物设计

4．2．2 反枝苋基因组DNA的提取

4．2．3 目的片段扩增

4．2．4 琼脂糖凝胶电泳

4．2．5 测序及序列分析

4．3 结果与分析

4．3．1 反枝苋总DNA提取

4．3．2 目的片段扩增

4．3．3 测序及序列分析

4．4 讨论

第五章 全文结论

参考文献

致谢

作者简历