柔嫩艾美耳球虫两个保守蛋白的初步研究

摘要

鸡球虫病在世界范围内严重影响养鸡业的健康发展，给养鸡业造成巨大的经济损失，该病主要是由艾美耳属球虫寄生于鸡肠道引起。在7种艾美耳球虫中，柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）是分布最广、致病力最强的球虫之一，它寄生在盲肠的黏膜下，引起出血性肠炎，可导致鸡死亡。鸡球虫属于顶复器门原虫，顶复器门原虫是一类专一性的细胞内寄生虫，这类寄生虫尽管入侵的宿主细胞各不相同，但它们都有一个共同保守的入侵机制，当虫体黏附宿主细胞后，在虫体顶端与宿主细胞膜表面形成一个紧密的运动接触环(Moving Junction，MJ)，这一特殊结构在虫体入侵宿主细胞过程中发挥至关重要的作用。研究发现由微线体分泌的顶体膜抗原1(Apicalmembrance protein-1，AMA1)是组成MJ的关键分子，因此，与AMA1相互作用的分子可能参与形成MJ，并在虫体入侵宿主细胞过程中必不可少。为了弄清楚柔嫩艾美耳球虫AMA1的相互作用分子以及在虫体入侵过程中发挥的作用，本实验室前期利用酵母双杂交技术，以柔嫩艾美耳球虫项体膜抗原1（EtAMA1）为诱饵，筛选了柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母双杂交cDNA文库，获得一些可能与EtAMA1相互作用蛋白的ESTs序列。本研究选取其中编号为559和39的两个EST序列，对其进行克隆、表达和功能初步分析，并对其与EtAMA1的相互作用关系进行了验证。
　　1.柔嫩艾美耳球虫CHP559和CHP39基因的克隆及生物信息学分析
　　选取的两个EST序列均含有3'末端的Ploy(A)尾，利用5'RACE技术获得了这两个基因含完整开放阅读框的全长cDNA序列，编号559与39基因的ORF分别与柔嫩艾美耳球虫保守的假想蛋白(hypothetical protein，conserved) ETH_00024035与ETH00029745有100％同源，因此，分别将2个基因命名为EtCHP559和EtCHP39。EtCHP559基因全长1746 bp，ORF长1224 bp，编码407个氨基酸，编码蛋白的分子量为46.04 kDa，有跨膜结构和信号肽，没有保守结构域，有15个抗原位点。EtCHP39基因全长1344 bp，ORF长873 bp，编码290个氨基酸，预测分子量为32.6 kDa，无跨膜结构和信号肽，没有保守结构域，有9个抗原位点。经荧光定量PCR检测发现，EtCHP559基因在孢子化卵囊和子孢子发育阶段有转录，子孢子阶段的转录水平最高，表明EtCHP559是在子孢子阶段高效表达的基因。EtCHP39基因在4个发育阶段均有转录，但转录水平不同，其中在孢子化卵囊阶段转录水平最高，其次在未孢子化卵囊的转录水平高于子孢子和裂殖子，表明EtCHP39基因的转录水平受到虫体阶段性的调控。
　　2.柔嫩艾美耳球虫两个保守蛋白EtCHP559和EtCHP39的原核表达及功能初步研究
　　将EtCHP559基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-2和pCold-TF中，转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导成功表达了重组蛋白GST-EtCHP559和His-EtCHP559，其中重组蛋白GST-EtCHP559为包涵体表达，重组蛋白His-EtCHP559有可溶性表达。将EtCHP39基因克隆到原核表达载体pET28a中，转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导成功表达了重组蛋白His-EtCHP39，且以包涵体形式表达。分别利用Ni柱亲和层析和切胶纯化的方式获得了重组蛋白His-EtCHP559和His-EtCHP39，用纯化的蛋白免疫家兔获得多抗血清，经Western-blot分析表明重组蛋白EtCHP559和EtCHP39都具有良好的免疫原性和反应原性。采用间接免疫荧光定位技术对EtCHP559和EtCHP39蛋白在球虫不同发育阶段的分布和定位进行分析，结果显示，EtCHP559蛋白在未入侵前主要位于子孢子的表面，当准备入侵时该蛋白的表达量上升并趋向于顶端，在子孢子接入DF-1细胞2h后，发现该蛋白主要位于虫体的顶端，子孢子入侵DF-1细胞24 h后，蛋白的表达增加，且逐渐往虫体的后端分泌;EtCHP39在未入侵前主要位于子孢子的顶端，当准备入侵时该蛋白分泌到子孢子的表面以及顶端，子孢子加入DF-1细胞2h后，发现该蛋白主要位于虫体的顶端，入侵DF-1细胞24 h后，蛋白的表达增加，且逐渐往虫体的后端分泌，当虫体发育为裂殖子时，该蛋白也主要位于裂殖子的顶端。通过体外抑制实验检测不同浓度的多抗对子孢子入侵DF-1细胞的影响，结果显示，anti-rEtCHP559抗体作用子孢子后，与正常兔血清IgG组相比子孢子入侵DF-1细胞的能力明显下降，且随着抗体浓度的不断增大，作用后子孢子入侵力逐渐降低，抗体抑制率逐渐升高，当抗体浓度为300μg/mL，抑制率高达70％; anti-rEtCHP39抗体作用子孢子后，与对照组相比子孢子入侵DF-1细胞的能力下降，且随着抗体浓度的不断增大，作用后子孢子入侵力逐渐降低，抗体抑制率逐渐升高，当抗体浓度为400μg/mL，抑制率为30％左右。
　　3.柔嫩艾美耳球虫CHP559和CHP39蛋白与AMA1蛋白互作关系的验证
　　利用真核表达的蛋白对EtCHP559和EtCHP39蛋白与EtAMA1蛋白的相互作用关系进行了验证。将EtCHP559和EtCHP39基因分别克隆至真核表达载体pcDNA3.1-flag和pBiFC-VC155，同时将EtAMA1基因分别克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)和pBiFC-VN155，所构建的真核重组表达质粒经PCR和双酶切鉴定正确后转染DF-1细胞进行表达，经Westem-blot和间接免疫荧光鉴定所构建的真核重组表达质粒在DF-1细胞内成功表达。利用构建的pcDNA3.1-flag-EtCHP559、pcDNA3.1-flag-EtCHP39和pcDNA3.1-EtAMA1质粒进行免疫共沉淀实验，结果显示Flag单抗可以沉淀DF-1细胞中表达的EtCHP559和EtCHP39蛋白，却不能同时沉淀DF-1细胞中表达的EtAMA1蛋白;利用构建的pBiFC-VC155-EtCHP559、pBiFC-VC155-EtCHP39和pBiFC-VN155-EtAMA1质粒转染DF-1细胞后进行双分子荧光互补实验，结果显示实验组和阴性对照组细胞均不能检测到明显荧光，阳性对照组细胞有明显绿色荧光。结果说明通过上述方法未能检测出EtCHP559和EtCHP39与EtAMA1存在相互作用。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 文献综述

1．1 微线体蛋白的黏附结构域

1．2 弓形虫微线体蛋白

1．3 柔嫩艾美耳球虫的微线体蛋白

1．4 疟原虫的微线体蛋白

1．5 顶复器门原虫顶体膜抗原1

第二章 柔嫩艾美耳球虫CHP559和CHP39基因的克隆及生物信息学分析

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．2．1 实验动物

2．2．2 实验虫株

2．2．3 主要实验试剂

2．2．4 主要实验仪器

2．2．5 试剂配制方法

2．2．6 柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段虫体的收集与纯化

2．2．7 柔嫩艾美耳球虫子孢子总RNA的提取

2．2．8 柔嫩艾美耳球虫子孢子RACE模板的制备

2．2．9 cDNA 5’末端序列的扩增

2．2．10 柔嫩艾美耳球虫两个保守蛋白基因的生物信息学分析

2．2．11 柔嫩艾美耳球虫子孢子cDNA的合成

2．2．12 目的基因开放阅读框的扩增

2．2．13 两个保守蛋白基因在柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段的转录水平分析

2．3 结果

2．3．1 柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段虫体的收集与纯化

2．3．2 柔嫩艾美耳球虫子孢子总RNA的提取

2．3．3 柔嫩艾美耳球虫两个保守蛋白基因的克隆

2．3．4 柔嫩艾美耳球虫两个保守蛋白基因的生物信息学分析

2．3．5 柔嫩艾美耳球虫两个保守蛋白基因在不同发育阶段的转录水平分析

2．4 讨论

第三章 柔嫩艾美耳球虫两个保守蛋白的原核表达及功能初步研究

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 实验动物

3．2．2 实验虫株、载体及细胞

3．2．3 主要实验试剂

3．2．4 主要实验仪器

3．2．5 主要实验试剂的配制

3．2．6 重组表达质粒pGEX-4T-2-EtCHP559和pET28a-EtCHP39的构建与鉴定

3．2．7 重组表达质粒pGEX-4T-2-EtCHP559和pET28a-EtCHP39的的表达

3．2．8 重组表达质粒pCold-TF-EtCHP559的构建、鉴定与表达

3．2．9 pCold-TF-EtCHP559和pET28a-EtCHP39表达重组蛋白的纯化

3．2．10 EtCHP559和EtCHP39重组蛋白多克隆抗体的制备与纯化

3．2．11 EtCHP559和EtCHP39重组蛋白免疫原性和反应原性分析

3．2．12 DF-1细胞的复苏与培养

3．2．13 EtCHP559和EtCHP39在柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段的分布与定位分析

3．2．14 EtCHP559和EtCHP39重组蛋白多克隆抗体对柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵细胞的体外抑制分析

3．3 结果

3．3．1 原核重组表达质粒的构建

3．3．2 重组蛋白的表达

3．3．3 重组蛋白的纯化

3．3．4 重组蛋白多克隆抗体的纯化

3．3．5 EtCHP559和EtCHP39重组蛋白免疫原性和反应原性分析

3．3．6 天然蛋白的间接免疫荧光定位

3．3．7 体外抑制实验

3．4 讨论

第四章 柔嫩艾美耳球虫CHP559和CHP39蛋白与AMA1蛋白互作关系的验证

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．2．1 主要实验试剂

4．2．2 主要实验仪器

4．2．3 EtCHP559、EtCHP39和EtAMA1在柔嫩艾美耳球虫子孢子的间接免疫荧光共定位分析

4．2．4 EtCHP559、EtCHP39和EtAMA1基因的克隆

4．2．5 重组真核表达质粒的构建

4．2．6 重组质粒转染DF-1细胞

4．2．7 Western blot鉴定重组真核表达质粒在DF-1细胞中的表达情况

4．2．8 间接免疫荧光鉴定重组真核表达质粒在DF-1细胞中的表达情况

4．2．9 免疫共沉淀

4．2．10 双分子荧光互补实验(BiFC)

4．3 结果

4．3．1 天然蛋白的间接免疫荧光共定位分析

4．3．2 真核重组表达质粒的构建

4．3．3 Western blot分析真核表达质粒在DF-1细胞中的表达情况

4．3．4 间接免疫荧光鉴定重组真核表达质粒在DF-1细胞中的表达情况

4．3．5 免疫共沉淀结果

4．3．6 BiFC检测蛋白间的相互作用

4．3 讨论

第五章 全文结论

参考文献

致谢

作者简历