不结球白菜种质资源抗TuMV鉴定评价及eIF(iso)4E基因克隆和序列分析

摘要

不结球白菜（Brassica campestrisL.ssp.chinensis）是我国重要蔬菜作物，病毒病的发生严重影响其产量和品质，芜菁花叶病毒（Turnip mosaic virus，TuMV）是主要毒源。筛选不同抗病基因源、深入挖掘抗病基因以促进分子标记辅助育种仍是防治病毒病最为经济和安全有效的解决途径。本论文以不结球白菜种质资源为研究对象，通过苗期TuMV抗性的鉴定评价，筛选不同抗病基因源;选取TuMV抗性差异大的材料为亲本，构建F2群体，进行TuMV抗性的遗传分析;通过克隆不结球白菜的eIF(iso)4E.a和eIF(iso)4E.c基因，比较分析序列多态性位点、不同变异位点对编码蛋白的影响以及与TuMV抗性的相关性。这将为进一步明确不结球白菜抗TuMV的分子机制奠定基础。主要研究结果如下:
　　1.利用苗期人工接种鉴定及ELISA检测方法，对127份不结球白菜种质资源进行TuMV抗性鉴定。结果显示，不同种质间表现出较大的抗性差异，病情指数（DI）分布在3.55～95.68之间。不同抗性级别的次数分布图基本符合正态分布，略向感病区域偏离，基于病情指数的聚类分析结果与抗病性分级基本一致。通过苗期鉴定共筛选获得6份高抗和13份抗TuMV种质，主要农艺性状表现出一定的多样性。117份供试种质ELISA检测的P/N值分布在3.10～25.37之间，不同种质间表现出病毒含量的差异，但与DI值未呈现明显相关性，可作为抗病材料筛选的辅助指标。
　　2.利用筛选获得的4份抗性差异较大的材料为亲本，构建3个F2群体。群体的TuMV抗病性鉴定结果显示，F1均表现感病，F2群体中抗感植株分离比均符合1∶3，推断两份抗病材料对TuMV-C4株系的抗性受一对隐性基因控制。
　　3.参考白菜基因组Bra035393和Bra035531的测序结果，通过克隆测序分别获得65份和38份不结球白菜种质的eIF(iso)4E.a和eIF(iso)4E.c基因序列。通过DNAMAN及DNASP软件比对分析表明，在eIF(iso)4E.a基因中共有33个SNP和11个InDel多态性位点，产生7种不同单倍型;eIF(iso)4E.c基因有19个SNP和5个InDel多态位点，产生8种单倍型。与已知白菜或油菜的基因序列比对，分别有13个(eIF(iso)4E.a）和15个(eIF(iso)4E.c）变异位点仅在不结球白菜中发现。核苷酸多样性指数(Pi)及Sliding-window分析均显示非编码区的多样性程度远高于编码区。eIF(iso)4E.a基因编码区有8个SNP变异位点，形成3种CDS，编码3种蛋白。3个错义突变位点导致氨基酸的变化为Asp27His、Thr79Ser和Phe108Ty。在eIF(iso)4E.c基因的5种CDS序列中仅有4个SNP变异位点，编码4种蛋白序列，2个错义突变位点导致氨基酸变化为Ile80Thr和Pro150Gln。通过SWISS-MODEL软件进行蛋白空间结构预测，表明氨基酸变异位点多数位于帽子口袋附近，导致部分空间结构的改变，推测可能影响不同蛋白序列中蛋白-蛋白结合位点的位置和数目。
　　4.用UCSC/Ensembl、NNPP、PLACE、PlantCARE和ARNold软件对5'和3'侧翼序列进行预测分析。结果显示，eIF(iso)4E.a基因转录起点位于起始密码子前52bp处，该基因的表达可能受光和胁迫调控，一些SNP或InDel的变异影响调控元件的有无或数量的多少，在终止密码子后543bp存在不依赖ρ因子的终止子。在eIF(iso)4E.c基因的3'侧翼序列中未预测到终止子的存在。
　　5.通过关联分析探讨不结球白菜不同单倍型和变异位点与TuMV抗性的关系，结果显示，两个基因的不同单倍型与TuMV抗性没有明显的相关性，仅eIF(iso)4E.a基因的InDel-6变异位点与TuMV抗性显著相关，但由于该位点仅存在于一份抗病材料中，其相关性极可能是假阳性。通过上述分析推断，eIF(iso)4E.a和eIF(iso)4E.c可能不是控制本试验不结球白菜对TuMV-C4株系抗性的主要基因。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 不结球白菜

1．2 TuMV的研究进展

1．2．1 TuMV的生物学特征和理化特性

1．2．2 TuMV的基因组结构和功能

1．2．3 TuMV的株系划分

1．2．4 TuMV的鉴定和检测技术

1．3 植物对病毒的显性抗性与隐性抗性

1．3．1 植物对病毒的显性抗性

1．3．2 植物对病毒的隐性抗性

1．3．3 RNA沉默介导的植物抗病毒机制

1．4 芸薹属作物TuMV抗性的研究

1．4．1 芸苔属作物种质资源对TuMV的抗性鉴定评价及抗病材料筛选

1．4．2 芸苔属作物抗TuMV遗传规律研究

1．4．3 芸薹属作物抗TuMV分子标记

1．4．4 芸薹属作物抗TuMV基因

1．5 遗传连锁图谱

1．6 本研究的目的和意义

第二章 不结球白菜种质资源对TuMV的抗性鉴定评价

2．1 材料与方法

2．1．1 试验材料

2．1．2 试验方法

2．2 结果与分析

2．2．1 供试不结球白菜种质的遗传多样性分析

2．2．2 不结球白菜对TuMV抗性的人工接种鉴定结果

2．2．3 不结球白菜TuMV抗性种质的筛选

2．2．4 ELISA检测

2．3 讨论

第三章 不结球白菜对TuMV抗性的遗传分析

3．1 材料与方法

3．1．1 试验材料与病毒株系

3．1．2 试验方法

3．2 结果分析

3．2．1 四个世代的抗病性鉴定评价结果

3．2．2 不结球白菜对TuMV抗病遗传规律的初步分析

3．3 讨论

第四章 不结球白菜eIF(iso)4E基因的克隆和序列分析

4．1 材料和方法

4．1．1 试验材料

4．1．2 试验方法

4．2 结果分析

4．2．1 eIF4E(iso)4E．a和eIF4E(iso)4E．c基因的克隆与聚类分析

4．2．2 eIE(iso)4E．a基因多态性分析及蛋白预测

4．2．3 eIF(iso)4E．c基因多态性分析及蛋白预测

4．2．4 eIF(iso)4E基因与TuMV抗性的关系

4．3 讨论

4．3．1 不结球白菜eIF(iso)4E基因结构分析

4．3．2 不结球白菜eIF(iso)4E基因多样性分析

4．3．3 不结球白菜eIF(iso)4E基因多样性分布

4．3．4 不结球白菜eIF(iso)4E基因转换和颠换的比较

4．3．5 不结球白菜eIF(iso)4E基因单倍型

4．3．6 不结球白菜eIF(iso)4E蛋白质预测

4．3．7 不结球白菜eIF(iso)4E基因变异位点与TuMV抗性关系

第五章 全文结论

参考文献

附录

致谢

作者简历