桑花叶型萎缩病病原的鉴定

摘要

桑花叶型萎缩病(Mulberry mosaic dwarf disease，MMDD)是一种困扰桑树生产长达数十年的重要病害，感病的桑树会表现出植株矮小、叶片花叶、畸形、皱缩、叶缘卷曲等症状，严重影响桑蚕产业的发展。虽然对该病害的研究开展了近一个世纪，但对于其病原却至今未明确。鉴于此，本研究以探究桑花叶型萎缩病的病原为目的，系统的开展研究工作。
　　首先，选取陕西省安康学院蚕桑科研基地进行样品采集，重点采集表现花叶型萎缩病症状的桑树样品92份，无症状样品9份。选取感病和健康样品各1份进行高通量测序技术，从感病样品中检测到2种病毒:双生病毒、线虫传多面体病毒和一种小分子环状RNA，而此健康样品中未检测到病毒病原物。通过RT-PCR/PCR实验验证了这三种病原物确实存在于感病样品中。
　　其次，对所有样品中这三种病原物的发生率进行了调查，发现感病的92份样品中，双生病毒的检出率为92.4％，线虫传多面体病毒的检出率为52.17％，小分子环状RNA的检出率为40.2％。因此，双生病毒与花叶型萎缩病的发生存在正相关关系;而线虫传多面体病毒的检出率也较高，与双生病毒可能存在混合侵染的情况存在;由于从健康的样品中也检测到小分子环状RNA的存在，因此小分子RNA与病害的发生没有相关关系。我们通过实验得出双生病毒与花叶型萎缩病具有极大的相关关系，但仍需根据科赫氏法则来进行致病性验证，最终确定是否为该病病原。
　　最后，鉴于此双生病毒与花叶型萎缩病的相关关系，将其命名为桑花叶型萎缩病相关病毒(Mulberry mosaic dwarf associated virus，MMDaV)，并对其进行了鉴定。采用PCR法和RCA的方法克隆得到了双生病毒的基因组全长序列(2952 nt)，单组份，单链环状DNA。除了具有双生病毒科病毒保守的结构之外，该病毒开放阅读框的个数及位置不同于其他双生病毒，病毒链含有5个，互补链含有2个，具有独特性。软件预测到互补链存在一个内含子(101 nt)，通过RT-PCR实验验证了这一预测，并结合高通量数据中存在139个RNA reads以外显子-外显子序列方式存在，进一步证明了体内剪切掉内含子的互补链转录本的存在，根据序列特征判断，该内含子属于U2型内含子。系统发育分析结果显示，桑树上的双生病毒与柑橘上发现的柑橘褪绿矮缩相关病毒(Citrus chlorotic dwarf associated virus，CCDaV)共同存在于一个单独的分支，且未归到已知的属中，因此，我们建议将这两种病毒共同归于一个新的属。
　　由于传统检测技术的局限性，桑花叶型萎缩病的病原一直未能明确。本研究的创新之处在于，打破传统检测技术的瓶颈，利用高通量测序技术快速筛选到感病样品中所有的病毒，通过病原发生率的调查找到与病害的相关关系，根据科赫氏法则进行生物学实验，最终鉴定出引起该病害的病毒，解决“桑花叶型萎缩病的病原是什么”这一关键科学问题。