O型口蹄疫病毒单域抗体的筛选和鉴定及其在口蹄疫检测中的应用

摘要

口蹄疫是一种急性、烈性、高度接触性传染病，由口蹄疫病毒感染所引起。包括猪、牛等在内的偶蹄兽动物动物为其易感宿主，对全球的畜牧业造成了巨大的损失。口蹄疫分为O、A、C、AsiaⅠ、SAT-1、SAT-2和SAT-3七个血清型。其中，O型口蹄疫是全球最主要的流行亚型。近几年来在我国及周边国家多次爆发O型口蹄疫，造成了重大经济损失。这迫切要求我们高度重视O型口蹄疫的流行，并加快O型口蹄疫的基础研究和防控技术的开发。
　　骆驼科动物的血清中除了存在常规抗体外，还存在天然缺失轻链的重链抗体。重链抗体的重链可变区，被称为单域抗体或者纳米抗体，可独立行使其抗原结合能力。单域抗体具有物理化学性质稳定、可溶性好、分子量较小、易于改造、易于在微生物系统中表达等优点，现已被应用于肿瘤诊断、疾病治疗、药物开发等领域中。
　　在本项研究中，我们使用O型口蹄疫灭活苗免疫双峰驼，构建了抗O型口蹄疫病毒的单域抗体噬菌体展示免疫文库。经测定，文库容量为1.2×108。经过四轮淘选，测序得到两株单域抗体序列，分别命名为sdAb-1和sdAb-2。目的片段扩增后经过酶切后与pSMK载体连接，构建pSMK-sdAb-1和pSMK-sdAb-2原核表达载体，转化大肠杆菌BL21(coden plus)。经SDS-PAGE检测，重组sdAb-1和sdAb-2得到了表达。重组蛋白使用树脂亲和层析方法进行纯化。双抗夹心酶联免疫吸附实验结果显示这两株抗体对O型口蹄疫病毒具有特异性结合的能力。表面等离子共振实验结果证明这两株单域抗体与O型口蹄疫病毒抗原的平衡解离常数为8.24×10-9和6.23×10-9，属于高亲和力抗体。间接免疫荧光实验显示量子点标价的单域抗体可用于检测BHK-21细胞中的口蹄疫病毒。此外，还进行了磁珠标记的单域抗体在O型口蹄疫的PCR和ELSIA的检测方法中应用的初步探索。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 口蹄疫及口蹄疫病毒

1．1．1 口蹄疫

1．1．2 口蹄疫病毒

1．2 单域抗体及单域抗体在兽医学领域的应用

1．2．1 单域抗体的研究进展

1．2．2 单域抗体在兽医领域的应用

第二章 抗O型口蹄疫病毒单域抗体噬菌体展示文库的构建及单域抗体的筛选

2．1 材料

2．2 实验方法

2．2．1 双峰驼免疫

2．2．2 淋巴细胞分离

2．2．3 噬菌体展示文库构建及单域抗体的筛选

2．2．4 单域抗体噬菌体展示文库库容量的测定

2．2．5 单域抗体序列分析

2．2．6 单域抗体基因的扩增

2．2．7 原核表达载体的构建与鉴定

2．2．8 单域抗体的表达及纯化

2．2．9 单域抗体的鉴定

2．3 实验结果

2．3．1 淋巴细胞总RNA提取

2．3．2 单域抗体基因扩增

2．3．3 库容量测定及单域抗体的筛选

2．3．4 单域抗体基因多序列比对

2．3．5 sdAb-1和sdAb-2基因扩增

2．3．6 pSMK-sdAb-1和pSMK-sdAb-2载体的双酶切鉴定

2．3．7 sdAb-1和sdAb-2的表达和纯化和Western Blotting验证

2．3．8 sdAb-1和sdAb-2的型特异性检测

2．3．9 sdAb-1和sdAb-2与O型口蹄疫病毒VP1蛋白的亲和力测定

2．4 讨论

第三章 单域抗体在O型口蹄疫检测中的应用

3．1 材料

3．2 试验方法

3．2．1 量子点标记的单域抗体检测细胞内的口蹄疫病毒

3．2．2 磁珠标记的单域抗体在口蹄瘦病毒的检测中应用

3．3 实验结果

3．3．1 量子点标记的单域抗体检测细胞内的口蹄疫病毒

3．3．2 磁珠标记的单域抗体在口蹄疫研究中的应用

3．4 讨论

第四章 全文结论

参考文献

致谢

作者简历