口蹄疫病毒A/GDMM/CHA/2013株VP1 H-2d限制性CTL表位预测与鉴定

摘要

口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒引发的一种以感染偶蹄动物为主的急性、烈性、热性、高度接触性传染病。其传播途径多、传播速度快、传染性强、病原变异大、严重危害畜牧业的发展和国家的经济贸易。在我国，口蹄疫的防制主要依赖于以强制免疫为主的综合免疫措施，但是目前使用的灭活疫苗有存在着许多缺憾，研究、开发安全、高效的新型疫苗是大势所趋。而表位肽疫苗正是其中一个研究热点。在口蹄疫病毒引发的免疫应答中，细胞免疫起着重要的作用，且结构蛋白VP1上有口蹄疫病毒主要的表位。因此，研究能够诱导细胞免疫应答的CTL表位，将加深对细胞介导的抗口蹄疫病毒免疫的了解，并为设计新型疫苗提供参考。
　　口蹄疫病毒A/GDMM/CHA/2013株是2013年广东省茂名分离的猪源毒，其很可能是由境外传入。因此，研究该毒株的细胞表位、发展相应疫苗，可能可以抵御外来疫情的传入。结构蛋白VP1上有口蹄疫病毒的主要抗原表位位点。研究根据GenBank中A/GDMM/CHA/2013株结构蛋白ⅥP1的序列，先借助计算机预测软件预测了A/GDMM/CHA/2013株VP1结构蛋白上H-2d限制性CTL细胞抗原表位，遴选出10条9肽的候选表位进行化学合成。然后用A/GDMM/CHA/2013活毒免疫小鼠，分离病毒特异性脾淋巴细胞，进而将其与候选表位体外共培养，通过T细胞增殖试验、Mouse IFN-γ ELISPOT试验和流式细胞术对候选表位进行鉴定。研究结果表明，预测的10条候选肽段中仅有2条H-2Dd限制性CTL细胞抗原表位，分别是:pD1(VGPTHVIDL)和pD4(KAPFTRLAL)。本研究为FMDV新的CTL细胞抗原表位的鉴定提供了参考方法，进一步充实了口蹄疫病毒抗原表位数据库资料，也为深入了解细胞介导的抗口蹄疫病毒免疫铺垫了基础。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 口蹄疫现状及其防治

1．1．1 口蹄疫病原学

1．1．2 口蹄疫流行病学

1．1．3 口蹄疫的防治

1．2 口蹄疫可替代疫苗策略

1．2．1 蛋白和多肽

1．2．2 弱毒疫苗

1．2．3 空衣壳

1．3 T细胞表位

1．3．1 T细胞表位的分子基础

1．3．2 MHC Ⅰ类抗原的加工和递呈

1．3．3 CTL的作用

1．3．4 口蹄疫CTL表位研究现状

1．4 T细胞表位的预测方法

1．5 细胞表位鉴定方法

1．5．1 T淋巴细胞增殖试验

1．5．2 ELISPOT

1．5．3 胞质内细胞因子染色

1．6 研究的目的和意义

第二章 FMDV A／GDMM／CHA／2013株结构蛋白VP1 CTL表位预测

2．1 材料与方法

2．1．1 序列分析

2．1．2 预测软件预测表位

2．1．3 候选表位的人工合成

2．2 实验结果

2．2．1 VP1基因序列分析

2．2．2 VP1蛋白CTL细胞表位预测

2．3 讨论

2．3．1 FMDV A／GDMM／CHA／2013株

2．3．2 结构蛋白VP1

2．3．3 CTL与T细胞表位

2．3．4 表位预测

第三章 FMDV A／GDMM／CHA／2013株结构蛋白VP1 CTL细胞表位的鉴定

3．1 实验材料

3．1．1 实验动物及细胞

3．1．2 毒株

3．1．3 主要试剂和仪器

3．2 实验方法

3．2．1 测定病毒毒价

3．2．2 BALB／c小鼠的免疫试验

3．2．3 抗体水平分析

3．2．4 小鼠淋巴细胞的分离

3．2．5 小鼠淋巴细胞的体外培养及活力测定

3．2．6 T细胞增殖测定

3．2．7 IFN-γ ELISPOT

3．2．8 流式细胞术检测

3．3 实验结果

3．3．1 病毒毒价测定

3．3．2 抗体滴度测定

3．3．3 小鼠淋巴细胞的活力

3．3．4 T细胞增殖

3．3．5 ELISPOT结果

3．3．6 流式细胞术结果

3．4 讨论

第四章 全文结论

参考文献

致谢

作者简历