猪札幌病毒主要非结构蛋白的表达及VP2互作分子的筛选

摘要

札幌病毒又名札如病毒，属于杯状病毒科札幌病毒属，是人和动物病毒性急性胃肠炎的主要病原体之一。主要通过粪-口途径传播，引起轻微腹泻或急性腹泻并伴有恶心、呕吐和腹痛等症状。近年来研究发现，札幌病毒不仅感染人，而且感染猪、牛、狗、猫、蝙蝠、水貂和海狮等动物。猪札幌病毒最早于1980年在美国被发现，随后，在许多国家都发现了该病毒，给养猪业造成了一定的威胁和损失。中国最早于2008年从腹泻猪的粪便中分离出了该病毒，随后的研究发现，该病毒不仅存在于腹泻猪群中，而且在无症状猪群中也有一定的检出率，存在隐性带毒现象，对养猪业生产存在潜在威胁。因此全面了解该病毒的生物学特性，探究该病毒在引起仔猪尤其是断奶仔猪腹泻中所起的作用，对于降低经济损失、保障人类健康，具有重要的意义。本研究利用原核表达系统获得了猪札幌病毒CH430株VPg、3C、3D、p70和VP25种重组蛋白及其多克隆抗体，并利用酵母双杂交系统初步筛选出23种与VP2相互作用的已知蛋白。
　　本研究首先采用一步法RT-PCR方法分别扩增猪札幌病毒CH430株VPg、3C、3D、p70、VP2目的片段，然后将这些目的片段分别亚克隆到pET-30a载体中，分别构建原核表达载体pET30a-VPg/3C/3D/p70/VP2，将其分别转化到表达菌BL21(DE3)中，经IPTG诱导表达，SDS-PAGE电泳确定得到的重组蛋白大小分别为22、23、67、81、26kDa，五种蛋白均主要以包涵体形式存在。采用Ni Sepharose6 Fast Flow纯化体系Ni-NTA亲和层析纯化方法进行纯化，获得浓度和纯度较高的VPg、3C、3D、 p70、VP2重组蛋白，Western-blot鉴定表明VPg、3C、3D、p70、VP2重组蛋白均具有良好的抗原性;利用纯化的蛋白免疫家兔制备高免血清，能够得到高滴度的多克隆抗体，Western-blot检测表明，五种多克隆抗体均能特异性识别相应的重组蛋白，为进一步研究上述蛋白的功能奠定了基础。
　　本研究进一步以猪小肠粘膜上皮组织为模型，构建其酵母双杂交cDNA文库转化入感受态Y187酵母细胞中。以猪札幌病毒VP2基因构建酵母双杂交诱饵质粒pGBKT7-VP2，并用醋酸锂法将其转化入Y2HGold酵母感受态细胞中，进行毒性检测和自激活检测;并将含有pGBKT7-VP2的Y2HGold酵母菌与猪小肠粘膜上皮组织cDNA文库Y187菌共培养，然后将杂交菌液通过4缺营养缺陷培养基筛选阳性克隆，并进行测序，用BLAST工具对测序结果进行同源性分析。结果表明诱饵质粒pGBKT7-VP2中的VP2蛋白在Y2HGold中获得表达，且不存在毒性和自激活现象。从猪小肠粘膜上皮组织cDNA文库中初步筛选到23个与VP2相互作用的已知蛋白，为进一步研究猪札幌病毒VP2的功能提供了新的线索，对猪札幌病毒分子致病机制的研究具有重要意义。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 札幌病毒的发现及命名

1．2 生物学分类地位

1．3 物理特性和稳定性

1．4 基因结构及功能

1．5 基因组序列和基因分型

1．6 基因重组

1．6．1 主要毒株的出现和演变

1．6．2 重组毒株

1．7 结构蛋白研究现状

1．7．1 VP1的研究现状

1．7．2 VP2的研究现状

1．8 非结构蛋白研究现状

1．9 细胞培养和动物感染实验

1．10 传播途径和宿主易感性

1．11 流行状况

1．11．1 国外流行状况

1．11．2 国内流行状况

1．12 临床症状

1．13 受体研究

1．14 检测方法

1．14．1 RT-PCR检测方法

1．14．2 ELISA检测方法

1．15 酵母双杂交系统

1．16 目的与意义

第二章 PoSaV CH430株VPg、3C、3D、p70和VP2的原核表达及多抗的制备

2．1 材料

2．1．1 菌种、毒株和载体

2．1．2 实验动物

2．1．3 主要试剂

2．1．4 仪器设备

2．1．5 培养基及溶液

2．2 方法

2．2．1 引物的设计与合成

2．2．2 病毒总RNA的提取

2．2．3 VPg、3C、3D、p70、VP2基因的RT-PCR扩增

2．2．4 纯化回收VPg、3C、3D、p70、VP2基因

2．2．5 VPg、3C、3D、p70、VP2基因与pMD19-T simple载体连接，构建重组质粒

2．2．6 重组质粒的转化及菌落筛选

2．2．7 质粒DNA提取

2．2．8 重组质粒双酶切鉴定及目的基因序列测定

2．2．9 原核表达质粒的构建

2．2．10 VPg、3C、3D、p70、VP2蛋白表达

2．2．11 表达产物的SDS-PAGE电泳鉴定

2．2．12 重组蛋白的可溶性分析

2．2．13 重组蛋白的纯化

2．2．14 兔源多抗的制备

2．2．15 Western-blot分析

2．2．16 ELISA测定超免疫血清的效价

2．3 结果与分析

2．3．1 VPg、3C、3D、p70、VP2片段的RT-PCR扩增

2．3．2 重组pMD19T-VPg／3C／3D／p70／VP2质粒的鉴定

2．3．3 重组原核表达载体pET30a-VPg／3C／3D／p70／VP2的鉴定

2．3．4 重组蛋白的鉴定

2．3．5 重组蛋白的可溶性分析

2．3．6 重组蛋白的纯化

2．3．7 Western-blot鉴定

2．3．8 抗体效价的检测

2．4 讨论

第三章 酵母双杂交系统筛选与VP2相互作用的宿主蛋白

3．1 材料

3．1．1 实验动物

3．1．2 菌株、表达载体及文库

3．1．3 主要试剂

3．2 方法

3．2．1 cDNA文库的构建

3．2．2 VP2蛋白基因的引物设计

3．2．3 VP2蛋白基因的PCR扩增

3．2．4 诱饵质粒pGBKT7-VP2的构建

3．2．5 酵母双杂交试验

3．3 结果与分析

3．3．1 猪小肠粘膜上皮组织总RNA的提取及均—化cDNA文库的构建

3．3．2 猪小肠粘膜上皮组织cDNA文库的鉴定

3．3．3 诱饵蛋白VP2的毒性检测和自激活检测

3．3．4 酵母双杂交筛选猪小肠粘膜上皮组织cDNA文库

3．3．5 阳性克隆测序结果

3．4 讨论

第四章 全文结论

参考文献

致谢

作者简历