小盐芥ThPIP1基因的水稻遗传转化及耐盐机理研究

摘要

在沿海、干旱和半干旱地区生长的植物常常受到盐胁迫，盐胁迫作为主要的非生物胁迫之一，影响植物的正常生长和发育，特别是对盐比较敏感的作物水稻而言，其生长和产量受到盐胁迫的制约。植物水通道蛋白(AQPs)是一类能够特异性转运水分子的膜蛋白，由于其参与到植物体内的多种生理代谢过程而受到广泛的关注，AQPs除了介导植物体内水分的跨膜转运外，对一些小分子物质如尿素、CO2、NH3等也具有转运活性，在植物应对非生物胁迫的生理过程中也发挥重要作用。小盐芥是一种典型的盐生植物，可以在高盐的环境中正常生长并完成其生命周期，因此，从小盐芥中挖掘相关的AQPs对提高植物在逆境中的适应性具有重要意义。
　　本实验从小盐芥中分离得到一个水通道蛋白基因ThPIP1，该基因开放阅读框为855bp，编码284个氨基酸，分子量约30.345 kD(GenBank登录号为:JX133234.1)。生物信息学分析发现该蛋白属于典型的质膜内在蛋白(MIP)家族，又称为AQP蛋白家族。ThPIP1具有AQPs家族保守的2个“NPA”特征结构单元和6个跨膜结构，与油菜和拟南芥中的PIP1类蛋白有较高的同源性。为明确ThPIP1在水通道蛋白中的分类，进行亚细胞定位实验，发现ThPIP1定位在细胞质膜上，属于PIP亚类。
　　利用qRT-PCR方法研究小盐芥在干旱、低温、NaCl胁迫条件下ThPIP1珀勺表达模式，结果发现:小盐芥ThPIP1的表达可以响应干旱、低温、NaCl等非生物胁迫因子，并随胁迫因子的不同和胁迫时间的长短具有不同的调控机制。其中ThPIP1在小盐芥受到盐胁迫2小时后，根部的表达量显著增加，表现出快速的反应调节能力。
　　为进一步研究小盐芥ThPIP1在应对盐胁迫时的生理功能，将其转化水稻品种日本Kitake，获得转基因水稻，从渗透调节和离子平衡两个方面分析了转基因水稻在盐胁迫环境下的耐盐性。研究发现:在NaCl胁迫下，转基因水稻植株长势优于野生型水稻，虽然受到高浓度盐胁迫，但是转基因水稻根系受抑制程度低，根系比野生型水稻根系长。盐胁迫条件下，转基因水稻的生物量和SPAD值也显著高于野生型植株，SPAD值是反映植物叶片叶绿素含量的指标，较高的SPAD值可以间接说明转基因水稻在盐胁迫下的光合作用较强。转基因水稻的组织渗透势在高盐浓度下显著降低，使植株保持较高的含水量，以满足盐胁迫下正常代谢所需的水分。此外，在盐胁迫下，转基因水稻体内积累更多的脯氨酸和可溶性糖等有机渗透调节物质，这些物质的积累也可以降低组织渗透势，保证水分的吸收。
　　丙二醛(MDA)是细胞质膜损伤程度的指标，MDA含量高意味着植物细胞膜损伤程度高，转基因水稻在盐胁迫下，MDA的含量显著低于野生型，这说明转基因水稻的细胞膜损伤程度比野生型水稻损伤程度轻，可以更好的维持体内的离子平衡。水稻植株Na+和K+含量测定显示，转基因水稻的K+/Na+显著高于野生型，这有利于减轻Na+的毒害。为进一步研究ThPIP1基因在转基因水稻中的离子调节机制，利用非损伤测试技术测定培养5天的水稻幼苗根尖分生区Na+和K+流速，结果表明:盐胁迫下，部分转基因水稻株系根尖的Na+外排显著增加，而K+外流速度却显著降低，这表明转基因水稻株系通过主动增加Na+的外排和K+的吸收来调节体内的Na+和K+平衡以维持较高的K+/Na+。因此，过表达ThPIP1基因的水稻通过降低细胞膜损伤、增加渗透调节物质和提高K+/Na+来应对盐胁迫。
　　为研究ThPIP1在植物耐盐生理调控的分子机制，利用分裂泛素化酵母双杂交系统初步筛选到小盐芥ThPIP1的2个互作蛋白:ThPIP2和非特异性脂类蛋白nsLTP2。ThPIP1和ThPIP2可能通过形成四聚体结构来调控水分转运活性，nsLTP2在植物体内参与脂类物质的跨膜转运、蜡质合成、抗逆等生理过程，由于ThPIP1与nsLTP2都参与到植物响应非生物胁迫的生理过程，因此它们可能以互作的方式在这些生理代谢中共同发挥作用。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 植物耐盐性的研究现状

1．1．1 盐胁迫对植物生长的影响

1．1．2 植物对盐胁迫的适应性机制

1．2 植物水通道蛋白

1．2．1 植物水通道蛋白的分类及其多样性

1．2．2 植物水通道蛋白的结构

1．2．3 植物水通道蛋白的功能

1．2．4 植物水通道蛋白的活性调控

1．2．5 植物AQPs与环境因子

1．3 立题目的与意义

1．4 技术路线

第二章 小盐芥ThPIP1的克隆和生物信息学分析

2．1 试验材料及仪器设备

2．1．1 植物材料

2．1．2 菌种及载体

2．1．3 酶及生化试剂

2．1．4 试剂盒

2．1．5 引物合成及测序

2．1．6 相关培养基的配制

2．1．7 主要仪器设备

2．1．8 引物设计和生物信息学分析软件

2．2 方法

2．2．1 小盐芥总RNA的提取与检测

2．2．2 反转录合成小盐芥cDNA与ThPIP1的克隆

2．2．3 PCR产物回收、连接与转化

2．2．4 质粒DNA的提取

2．2．5 DNA序列测定

2．3 结果与分析

2．3．1 小盐芥ThPIP1基因的克隆

2．3．2 ThPIP1基因编码蛋白的理化性质

2．3．3 ThPIP1基因进化分析及编码蛋白跨膜结构预测

2．3．4 ThPIP1磷酸化位点和疏水性分析及亚细胞定位预测

2．4 小结

第三章 小盐芥ThPIP1的亚细胞定位及ThPIP1基因逆境胁迫下的表达模式

3．1 试验材料

3．1．1 菌种及载体

3．1．2 植物材料

3．1．3 酶、试剂和仪器

3．1．4 培养基配制

3．1．5 溶液配制

3．2 方法

3．2．1 亚细胞定位表达载体的构建

3．2．2 基因枪轰击洋葱表皮亚细胞定位细胞方法与步骤

3．2．3 PEG介导转化拟南芥原生质体亚细胞定位细胞方法与步骤

3．2．4 野生小盐芥中ThPIP1非生物胁迫下表达模式的分析

3．3 结果与分析

3．3．1 亚细胞定位载体构建

3．3．2 洋葱表皮亚细胞定位的瞬时表达

3．3．3 ThPIP1蛋白在拟南芥原生质体中的亚细胞定位

3．3．4 小盐芥中ThPIP1基因非生物胁迫下的表达模式

3．4 小结

第四章 构建植物表达载体并转化水稻以及转基因水稻的耐盐性分析

4．1 实验材料

4．1．1 植物材料

4．1．2 载体及菌种

4．1．3 酶及生化试剂

4．1．4 营养液及实验试剂的配制

4．1．5 主要仪器设备

4．2 实验方法

4．2．1 植物表达载体的构建

4．2．2 农杆菌转化

4．2．3 农杆菌介导转化水稻愈伤组织

4．2．4 转基因水稻植株的筛选与检测

4．2．5 转基因水稻的盐处理

4．2．6 转基因水稻的生理指标测定

4．2．7 试验数据统计分析

4．3 结果与分析

4．3．1 植物表达载体的构建

4．3．2 转基因水稻植株的筛选与检测

4．3．3 盐胁迫对野生型和转基因拟南芥表型特征的影响

4．3．4 盐胁迫对野生型和转基因水稻生物量和SPAD的影响

4．3．5 盐胁迫对水稻植物组织含水量和渗透势的影响

4．3．6 盐胁迫下水稻脯氨酸和可溶性糖含量的变化

4．3．7 盐胁迫下水稻丙二醛含量和K+／Na+的变化

4．3．8 盐胁迫下水稻植株离子含量的变化

4．4 小结

第五章 小盐芥ThPIP1水通道蛋白互作蛋白的筛选

5．1 实验材料

5．1．1 载体和菌株

5．1．2 酶和试剂

5．1．3 溶液配制

5．1．4 主要仪器设备

5．2 方法

5．2．1 诱饵蛋白载体的构建

5．2．2 诱饵蛋白载体ThPIP1-pDHB1转化酵母细胞

5．2．3 小盐芥cDNA文库转化携带ThPIP1-pDHB1质粒的酵母细胞

5．2．4 酵母单克隆β半乳糖苷酶活性的验证

5．2．5 阳性克隆序列分析

5．2．6 靶蛋白与ThPIP1蛋白在酵母中的互作验证

5．3 结果与分析

5．3．1 膜酵母双杂交从小盐芥cDNA文库中筛选ThPIP1的互作蛋白

5．3．2 获得的靶蛋白与ThPIP1在酵母中的互作验证

5．3．3 互作蛋白的生物信息学分析

5．4 小结

第六章 全文结论

参考文献

致谢

作者简历