猪CD16及其介导PRRSV抗体依赖性增强作用研究

摘要

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV)引起的一种急性传染病，是目前严重危害世界养猪业的一种重要病毒病，给养猪业造成了巨大经济损失。为了有效的控制该病的发生，众多科学家从事疫苗的开发和研究。然而，由于动物猪体在感染PRRSV后所产生的免疫反应和疾病的发展过程受多种因素的影响，致使疫苗的免疫效果不尽人意:其中，病毒感染的抗体依赖性增强作用（antibody-dependent enhancement，ADE）是关键影响因素之一。ADE即指机体的抗体水平在未达到中和抗体浓度时，可协助病毒进入靶细胞，提高感染效率。
　　目前．ADE作用已在多个科属的40多种病毒的感染中发现，如登革热病毒、人免疫缺陷病毒、西尼罗河病毒等。与PRRSV相似的是这些病毒多表现为嗜好在免疫细胞中繁殖，容易引发宿主的持续性感染。常规疫苗免疫防制这类具有ADE作用的病毒病时常常难以奏效，动物免疫后，对该病毒的易感性反而会增加。因此，有必要利用病毒模型，探讨ADE在这类病毒中的致病机制。
　　因此，为了更有效的防控PRRS的发生，本课题即从ADE角度出发，阐释了PRRSV的致病机理。本研究发现当亚中和活性的PRRSV特异性抗体存在时，PRRSV体外感染猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages，PAMs)能力增强，即，亚中和活性的抗体可促进病毒的感染和释放。已有的报道表明，介导ADE效应的细胞表面分子有三种Fcγ受体(FcγRs)，即:FcγRⅠ(CD64)、FeγRⅡ(CD32)和FcγRⅢ(CD16)。通过运用荧光定量PCR方法，本研究发现CD16在PAMs的转录水平远远高于CD32和CD64;同时，流式细胞术和Western blotting的结果也表明CD16在PAMs上高效表达。因此，本研究对猪源CD16在PRRSV的ADE效应中发挥的作用进行研究。
　　首先，运用抗CD16的单克隆抗体特异性阻断PAMs表面的CD16，探究CD16在PRRSV的ADE效应中是否发挥作用。结果发现，CD16功能被抗体特异性阻断后，PRRSV亚中和活性的抗体引发的PRRSV的ADE效应显著降低，说明PAMs表面的CD16能够介导PRRSV的ADE。由于PAMs表面存在三种不同的FcγRs，为了特异性研究CD16，本研究在无FcγRs表达的HEK293-T细胞和COS-7细胞上特异性表达猪源CD16，进一步验证CD16介导的ADE效应。研究结果发现，PRRSV-抗体免疫复合物可特异性吸附在HEK293-T/CD16细胞和COS-7/CD16细胞，进而使得PRRSV内化进入细胞。最后，本研究还发现内化的PRRSV可以在这些细胞内发生复制，并释放出具有活性的子代病毒。此外，本研究还证明猪源CD16的高效表达需要和Fc受体γ链的协同表达。
　　本研究对PRRSV的ADE效应提出新的机制，即首次证明CD16能介导PRRSV的ADE，为进一步揭示PRRSV的致病机制提供新理论。本研究提示当动物机体存在亚中和活性的抗体时，PRRSV可能对CD16阳性的细胞具有一定的趋化性，使得PRRSV在感染的过程中有更广泛的分布性，本研究为PRRSV疫苗的研究提供了新思路。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 猪繁殖与呼吸综合征概况

1．1．1 病原学和分子生物学

1．1．2 临床症状

1．1．3 发病机制

1．1．4 PRRS疫苗的发展及目前存在的问题

1．2 抗体依赖增强作用(ADE)的研究概况

1．2．1 ADE的机理研究

1．2．2 ADE带来的问题

1．2．3 PRRSV的ADE研究

1．3 IgGFe受体概况

1．3．1 FcγRⅠ(CD64)

1．3．2 FcγRⅡ(CD32)

1．3．3 FcγRⅢ(CD16)

1．4 研究的目的和意义

第二章 CD16多克隆抗体的制备及其真核表达质粒的构建

2．1 材料和方法

2．1．1 载体、感受态、细胞与实验动物

2．1．2 主要试剂

2．1．3 猪肺泡巨噬细胞(PAMs)的分离

2．1．4 pET-30a／CD16原核表达质粒的构建

2．1．5 pcDNA3．1／CD16与pcDNA3．1／FcRγ真核表达质粒的构建

2．1．6 重组质粒的诱导表达及蛋白的纯化

2．1．7 多克隆抗体的制备

2．1．8 Western-blotting

2．2 结果

2．2．1 原桉表达质粒pET-30a／CD16的构建及鉴定

2．2．2 真棱表达质粒pcDNA3．1／CD16、pcDNA3．1／FcRγ的构建及鉴定

2．2．3 重组蛋白的诱导表达及纯化

2．2．4 CD16多克隆抗体的验证

2．3 讨论

第三章 PRRSV的ADE

3．1 材料和方法

3．1．1 实验毒株与细胞

3．1．2 主要试剂

3．1．3 PRRSV免疫血清

3．1．4 PAMs上检测PRRSV的ADE

3．1．5 CD16单克隆抗体抑制PRRSV的ADE

3．1．6 相对荧光定量PCR

3．1．7 流式细胞术

3．1．8 数据分析

3．2 结果

3．2．1 PRRSV的免疫血清增强PRRSV在PAMs上的感染

3．2．2 抗体阻断CD16可抑制PRRSV的ADE效应

3．3 讨论

第四章 PRRSV的ADE的机理研究

4．1 材料和方法

4．1．1 细胞和质粒

4．1．2 主要试剂

4．1．3 CD16在COS-7和HEK293-T细胞上的表达

4．1．4 PRRSV免疫复合物感染表达CD16的COS-7和HEK293-T细胞

4．1．5 激光共聚焦技术检测细胞内的PRRSV

4．1．6 间接免疫荧光实验

4．1．7 蚀斑形成实验

4．2 结果

4．2．1 CD16能介导PRRSV免疫复合物的吸附

4．2．2 CD16能介导PRRSV免疫复合物的内化

4．2．3 PRRSV在表达CD16的COS-7细胞上的复制与释放

4．3 讨论

第五章 全文结论

参考文献

致谢

作者简历