大豆脂肪酸组分QTL定位与相关候选基因分析

摘要

大豆油脂是世界植物油脂的主要来源，因其对人类和植物具有重要的生理功能而倍受关注。由于大豆脂肪酸受遗传和环境因子综合影响，因此开展多环境条件下大豆脂肪酸主要组分QTL定位和候选基因克隆研究，对大豆脂肪酸分子标记辅助育种具有重要意义。本文在建立了大豆脂肪酸组分的定性定量测定方法基础上，选用以鲁黑豆2号(LHD2)×南汇早黑豆(NHZ)为亲本构建的重组自交系群体（RIL，F5∶7-8）为材料，结合多环境下的脂肪酸含量数据以及所构建的基于SSR和SNP标记的大豆高密度遗传连锁图谱信息，采用生物信息学分析方法，进行多环境条件下脂肪酸主要组分的QTL定位和生物学信息分析;挖掘与脂肪酸相关的候选基因，经与参考基因组比对，并将其编码基因在双亲中进行同源克隆和测序分析，发现双亲间存在差异的基因;通过设计特异性引物，在RIL群体中验证连锁关系;采用实时定量PCR方法，检测候选基因在种子发育过程中的时空表达变化，探索这两个基因与脂肪酸合成途径的相关性。其主要研究结论如下:
　　1.定性定量检测大豆脂肪酸组分的气相色谱方法
　　采用加热甲酯化提取法和气相色谱分析法(GC)，以5种脂肪酸甲酯（亚麻酸甲酯、油酸甲酯、棕榈酸甲酯、亚油酸甲酯和硬脂酸甲酯）为标准样品，在制定5种脂肪酸甲酯组分的标准曲线(R2＞0.99)和回归方程的基础上，建立了大豆脂肪酸组分的定性定量测定方法。该方法可以定性定量准确检测大豆籽粒中脂肪酸组分的绝对含量。通过对4个油份含量不同的大豆品种脂肪酸含量测定以及与粗脂肪含量的比较分析发现，该方法可显著提高籽粒中的脂肪酸提取率和检测效率，其检测的总脂肪酸含量占总油脂含量的94％以上。该方法不仅能检测样品中5种脂肪酸组分的相对百分比含量，还可以准确计算出籽粒中各个脂肪酸组分的绝对含量，对大豆脂肪酸检测及育种具有重要意义。
　　2.基于SSR和SNP标记的大豆脂肪酸组分的QTL定位
　　以包含110个家系的RIL群体为材料，构建一张包含161个SSR标记的遗传连锁图谱，图谱全长3591.18 cM，标记间平均图距为22.31 cM。结合3年大豆籽粒的脂肪酸组分相对含量表型数据，利用ICIMpping v3.3软件，采用ICIM方法进行QTL定位，共检测到与脂肪酸相关的QTL52个，分布于除4号染色体以外的其他19个连锁群上，表型贡献率为5％～40％。其中，15个QTL为新定位到的位点。另外，在多环境和多组分间定位到的QTL有17个，表型贡献率为5％～24％。
　　为了实现大豆脂肪酸组分的精细定位，采用SLAF-seq的方法构建了一张包含5785个SNP标记的高密度遗传连锁图谱，总长度为2255.18 cM，标记间的平均距离为0.39 cM。采用ICIM方法定位到与脂肪酸组分相关的QTL24个，分布于12条连锁群。这些QTL可解释表型变异7％～31％，LOD值在3.66～10.4之间。其中，3个QTL(qS-FA12-1、qS-OA16-1和qS-LNA20-1)在多个环境下均被检测到与同一脂肪酸组分相关，2个QTL（qS-FA7-1和qS-FA12-2）被检测到同一环境下调控不同脂肪酸性状。在基于SSR标记定位到的控制亚麻酸合成的QTL qLNA6-1在多环境下表现稳定，PVE高达28.76％，可视为主效QTL。经过SNP标记的精细定位，在该区间内精细定位到4个QTL:与亚油酸相关的qS-LA6-1、与亚麻酸相关的qS-LNA6-1、与油酸相关的qS-OA6-1和与棕榈酸相关的qS-PA6-1，其表型贡献率在11.4％～23.1％之间，为下一步的候选基因克隆奠定了基础。
　　3.大豆脂肪酸相关候选基因的克隆与差异比较
　　通过与参考基因组比对，对关键区间内10个候选基因进行了克隆和测序，发现两个基因在双亲间存在差异，经GO注释，发现分别为DOF类转录因子基因Gm08DOF-1和MYB类转录因子基因Gm20MYB-1。Gm08DOF-1在双亲中有连续3个碱基的InDel缺失变异，引起NHZ中一组甘氨酸的缺失;Gm20MYB-1在双亲中发现一个SNP（C/T）差异，相应引起苯丙氨酸和亮氨酸编码的变化。利用2对特异性引物对2个差异位点在RIL群体中的表现进行检测，结合三个环境下的脂肪酸含量数据进行方差分析和关联分析。结果显示，除硬脂酸组分外，其余四种脂肪酸组分均在不同环境下与2个差异位点呈现显著相关。
　　4.大豆脂肪酸相关候选基因的时空表达分析
　　以LHD2和NHZ开花后30天、40天、50天和60天的种子为材料，采用real-time PCR方法分析2个转录因子Gm08DOF-1和Gm20MYB-1，以及4个关键酶基因FAD2A、FAD3B、FAD2C和FAD3C在种子成熟过程中的时空表达模式。LHD2的种子在发育的50～60天时2个饱和脂肪酸硬脂酸和棕榈酸含量明显下降，而此时Gm08DOF-1和Gm20MYB-1的表达量都明显上升，由此可见，两个转录因子基因可能在饱和脂肪酸去饱和过程中发挥主要作用。同样我们也检测了脂肪酸在种子发育过程中关键酶基因的表达变化，发现FAD3B和FAD2C在NHZ中的表达量与2个饱和脂肪酸棕榈酸和硬脂酸含量呈极显著正相关，与亚油酸呈极显著负相关。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 大豆脂肪酸概述

1．1．1 大豆脂肪酸组分

1．1．2 脂肪酸的主要功能

1．1．3 脂肪酸含量测定

1．1．4 大豆脂肪酸遗传机制

1．2 脂肪酸合成路径及相关调节

1．2．1 大豆脂肪酸合成路径

1．2．2 脂肪酸合成关键酶调节

1．2．3 脂肪酸相关转录因子调节

1．2．4 Dof转录因子调节

1．3 大豆脂肪酸QTL定位

1．4 脂肪酸相关基因克隆研究及技术

1．4．1 脂肪酸关键酶基因克隆

1．4．2 脂肪酸相关转录因子基因克隆

1．4．3 SNPs检测

1．4．4 RT-PCR技术

1．5 本研究的目的与意义

第二章 定性定量检测大豆脂肪酸组分的气相色谱方法

2．1 材料方法

2．1．1 供试材料

2．1．2 试验试剂

2．1．3 脂肪酸组分的气相色谱检测条件

2．1．4 脂肪酸标准曲线的制作

2．1．5 豆粉脂肪酸提取

2．1．6 粗脂肪的NIRS检测

2．1．7 数据统计分析

2．2 结果分析

2．2．1 大豆脂肪酸组分的定性分析

2．2．2 脂肪酸甲酯标准曲线的制作

2．2．3 两种大豆脂肪酸提取方法测定效果比较

2．2．4 方法重现性分析

2．3 讨论

2．3．1 不同脂肪酸检测方法的比较

2．3．2 豆粉中的脂肪酸甲酯化充分与否是保证检测准确性的关键

2．4 本章小结

第三章 基于SSR标记的大豆脂肪酸加性及上位性QTL分析

3．1 材料与方法

3．1．1 试验材料与田间设计

3．1．2 大豆籽粒脂肪酸的提取与检测

3．1．3 分子标记与基因型分析

3．1．4 连锁图谱构建和数据分析

3．2 结果与分析

3．2．1 大豆籽粒脂肪酸各组分含量的表型分析

3．2．2 大豆脂肪酸组分相关性分析

3．2．3 大豆脂肪酸主要组分QTL定位分析

3．2．4 大豆脂肪酸QTL间信息比对分析

3．2．5 大豆脂肪酸上位性QTL分析

3．3 讨论

3．3．1 脂肪酸为数量性状受环境影响

3．3．2 控制脂肪酸组分QTL间的比较分析

3．3．3 微效QTL的局限性

3．4 本章小结

第四章 基于SNP标记的大豆脂肪酸组分的QTL分析

4．1 材料与方法

4．1．1 试验材料

4．1．2 试验方法

4．2 结果与分析

4．2．1 大豆RIL群体脂肪酸组分分析

4．2．2 与脂肪酸组分相关的加性QTL分析

4．2．3 与脂肪酸组分相关的上位性QTL分析

4．2．4 与脂肪酸组分相关的环境互作QTL分析

4．3 讨论

4．3．1 基于SNP标记构建的高密度图谱定位结果与基于SSR标记定位结果的比较

4．3．2 脂肪酸相关QTL区间内及同一连锁群上相关基因分析

4．4 本章小结

第五章 调控大豆脂肪酸合成的相关候选基因筛选、克隆及表达模式分析

5．1 试验材料与试剂

5．1．1 试验材料

5．1．2 菌株

5．1．3 工具酶及生化试剂

5．1．4 主要机器设备

5．1．5 PCR引物

5．2 试验方法

5．2．1 不同时期大豆种子脂肪酸的提取

5．2．2 GC气相色谱法检测大豆种子中脂肪酸含量

5．2．3 大豆叶片DNA、RNA提取及cDNA的合成

5．2．4 目的片段的克隆及产物回收

5．2．5 目的DNA片段与T载体的连接及大肠杆菌感受态细胞的转化

5．2．6 质粒DNA的提取

5．2．7 基因编码序列的获得与比较分析

5．2．8 Gm08DOF-1和Gm20MYB-1的差异性引物的群体检测

5．2．9 Real-time PCR分析

5．2．10 数据整理与统计分析

5．3 结果与分析

5．3．1 两个转录因子的编码序列的比对

5．3．2 两个转录因子基因与脂肪酸组分的连锁关系分析

5．3．3 种子发育过程中脂肪酸含量变化趋势

5．3．4 两基因的时空表达变化与脂肪酸含量的相关性

5．3．5 脂肪酸合成相关酶基因的表达变化与脂肪酸含量的相关性

5．4 讨论

5．4．1 基于参考基因组序列对比，可加速精细QTL区间相关基因的克隆与功能验证

5．4．2 大豆脂肪酸在不同品种种子发育过程中积累变化存在差异

5．4．3 调节脂肪酸合成相关酶基因的表达可能改变大豆种子中的脂肪酸配比

5．5 本章小结

第六章 全文结论

参考文献

附录

致谢

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