隐孢子虫病免疫学诊断方法的建立和应用及其免疫预防研究

摘要

作为腹泻病常见病原之一的隐孢子虫（Cryptosporidium spp.）能侵入人或动物的肠道，引起隐孢子虫病（cryptosporidiosis）。在隐孢子虫的众多种类中，微小隐孢子虫（Cryptosporidiumparvum）是最常见且危害最大的。对免疫功能发育不全或缺陷的宿主，隐孢子虫会造成严重的伤害，甚至会威胁生命。目前，隐孢子虫病防控研究面临着缺乏敏感、特异、便捷的诊断技术和有效的治疗、免疫预防方法。因而，筛选免疫原性好、免疫反应性高的隐孢子虫抗原分子，研制敏感、特异的诊断技术和高保护效果的预防疫苗是当前隐孢子虫病研究的关键和重要方向。
　　本研究以重组微小隐孢子虫CP15/60（rCP15/60）和类钙调蛋白(rCML)为抗原，建立了2个隐孢子虫病间接ELISA诊断方法，并与nested PCR方法进行了比较;利用建立的方法，对从上海地区3个屠宰场采集的猪田间血清进行了检测。结果显示，两种重组蛋白的最适包被浓度均为2μg/mL，一抗血清的最佳稀释度均为1∶100，酶标二抗的最佳稀释度也均为1∶800。与nested PCR法检测结果比较，rCP15/60-ELISA的阳性和阴性符合率分别为100.0％和80.0％; rCML-ELISA的阳性和阴性符合率分别为66.7％和60.0％。利用2种方法分别对291份田间样品进行检测，结果rCP15/60-ELISA法检测的阳性率为59.5％，rCML-ELISA法的阳性率为51.5％，前者比后者更敏感。交叉试验结果显示，2种方法对猪附红细胞体感染猪血清、弓形虫感染猪血清、猪瘟病毒感染猪血清、猪蓝耳病毒感染猪血清的检测结果均为阴性。利用rCP15/60-ELISA方法对341份猪田间样品进行检测，结果阳性率为56.89％;利用rCML-ELISA方法对353份猪田间样品进行检测，阳性率为44.47％，提示这2种ELISA方法的敏感性较高、特异性较强，可用于实验室初筛和隐孢子虫病的流行病学调查。
　　为了观察CP15/60、CML2种抗原制备的疫苗对小鼠隐孢子虫病的免疫预防效果，并与其它部分抗原进行比较，将重组蛋白rCP15/60、rCML，以及rCpT全、rCpTm、rENO、rP23四个重组蛋白分别与弗氏佐剂充分乳化，通过多次皮下注射的方式免疫小鼠，观察其体液免疫和细胞免疫应答反应;同时，对小鼠进行泰泽隐孢子虫卵囊人工感染，观察免疫小鼠的排卵囊情况。结果显示，6个亚单位疫苗免疫试验组小鼠血清IgG抗体水平、TNF和IL-5细胞因子、脾脏CD4+和CD8+含量都有不同程度提高，说明6组亚单位疫苗都特异性地诱导产生了体液免疫和细胞免疫反应。人工感染试验结果显示，rCP15/60免疫组的减卵囊率达45.57％，仅次于rENO免疫组，高于其它各组;rCML免疫组的减卵囊率达34.08％，次于rENO免疫组，与rP23免疫组基本相当，但高于rCpTm和rCpT全免疫组。上述结果表明，利用rCP15/60和rCML制备的亚单位疫苗对小鼠泰泽隐孢子虫感染均有较好的免疫保护效果，能诱导宿主产生了显著的体液和细胞免疫反应，是隐孢子虫病预防疫苗的重要候选抗原，有较高的研究价值。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 隐孢子虫主要诊断方法

1．2 隐孢子虫病治疗的现状

1．3 隐孢子虫病免疫反应和疫苗的发展

1．4 总结

第二章 基于重组CP15／60和类钙调蛋白的隐孢子虫间接ELISA检测方法的建立及上海地区猪隐孢子虫感染情况调查

2．1 实验材料

2．1．1 质粒和菌株

2．1．2 主要试剂

2．1．3 血清及粪便

2．1．4 主要溶液的配制

2．1．5 主要仪器

2．2 实验方法

2．2．1 重组蛋白制备

2．2．2 SDS-PAGE分析

2．2．3 Western blot分析

2．2．4 基于rCP15／60和rCML的隐孢子虫病间接ELISA(分别简称rCP15／60-ELISA和rCML-ELISA)检测方法的建立

2．2．5 批内和批间重复性试验

2．2．6 阴、阳性符合率试验

2．2．7 交叉反应试验

2．2．8 田间样品检测

2．3 结果

2．3．1 rCP15／60和rCML蛋白的表达与纯化

2．3．2 重组蛋白的Western blot分析

2．3．3 间接ELISA检测方法的建立

2．3．4 重复性试验结果

2．3．5 阴、阳性符合率试验

2．3．6 交叉反应试验结果

2．3．7 田间样品检测

2．4 讨论

第三章 二种亚单位疫苗对小鼠隐孢子虫人工感染的免疫保护效果及与其它抗原的比较研究

3．1 实验材料

3．1．1 虫种与实验动物

3．1．2 重组质粒和菌株

3．1．3 主要试剂

3．1．4 主要溶液的配制

3．1．5 主要仪器

3．2 实验方法

3．2．1 重组蛋白的制备

3．2．2 动物分组及免疫

3．2．3 体液免疫水平的检测

3．2．4 细胞免疫水平的检测

3．2．5 卵囊排出量检测

3．3 结果

3．3．1 体液免疫水平的检测结果

3．3．2 T淋巴细胞亚群检测结果

3．3．3 MTS淋巴细胞增殖试验结果

3．3．4 细胞因子检测结果

3．3．5 卵囊排出量检测结果

3．4 讨论

第四章 全文结论

参考文献

致谢

作者简介