两种侧耳高温胁迫导致的细胞凋亡研究和球孢白僵菌胁迫响应转录机制的研究

摘要

含有核心序列的探针均发生了凝胶迁移现象，BbMSN2可以和含有核心序列探针结合，相比未突变的探针，点突变的探针与BbMSN2的结合能力发生了显著的降低。这也说明BbMSN2对AGGGG/CCCCT序列的识别具有很强的特异性。
　　另外，BbMSN2蛋白和球孢白僵菌毒力和生长相关基因启动子的凝胶迁移实验表明，BbMSN2蛋白可以和蛋白酶基因(SSP和CDEP-1)及几丁质酶基因(Chitinase，CHIT1)的启动子结合，但BbMSN2与启动子相互作用的的亲和力较弱，KD值约为0.39μM。同时，分别用含有AGGGG/CCCCT序列和点突变核心序列的探针对BbMSN2和CDEP-1启动子结合体系进行竞争性实验(Competition Assay)，结果也表明，BbMSN2对AGGGG/CCCCT序列的识别具有特异性，同时不同的点突变序列对蛋白和核酸结合体系竞争效果有差异。
　　MBF1是转录辅激活因子，多项研究表明它能与其他辅助因子一起桥连通用转录因子TBP与靶基因启动子上游的保守序列TATA-box特异结合，调控或激活靶基因转录。但在丝状真菌中TBP和MBF1相互作用及TBP与TATA-box相互作用的研究很少。为了探究球孢白僵菌中BbTBP与TATA-box的相互作用，将BbTBP蛋白和合成的TATA-box核心序列探针结合，应用凝胶迁移实验方法，检测BbTBP与TATA-box体外的相互作用，结果表明:BbTBP可以和TATA-box核心序列探针相互作用，且BbTBP与TATA-box核心序列的亲和力很强，KD值为1.2 nM。
　　为了探究BbMBF1与BbTBP蛋白间相互作用，将BbMBF1、BbTBP和TATA-box核心序列的探针一起混合，通过凝胶迁移实验检测探针的迁移情况。结果表明，BbMBF1存在的情况下，含有TATA-box核心序列的探针发生了凝胶的Super-shift现象。另外，我们尝试了一种基于电化学阻抗谱(Electrochemical Impedance Spectroscopy，EIS)方法建立的生物传感器，对BbTBP和TATA-box相互作用及BbTBP与BbMBF1的相互作用进行了阻抗分析。测试的结果和凝胶迁移实验结果一致。以上结果表明:1.BbTBP可以和含有TATA-box核心序列探针结合;2.BbMBF1可以和BbTBP发生相互作用;3.BbMBF1不能直接和TATA-box核心序列探针结合;4.BbTBP可能调控BbMBF1与TATA-box核心序列的相互作用。

目录

声明

第一章 文献综述

1．1 细胞凋亡概述

1．2 丝状真菌细胞凋亡的研究方法

1．2．1 细胞核浓缩的检测

1．2．2 活性氧积累的检测

1．2．3 DNA断裂的检测

1．3 丝状真菌细胞凋亡的研究进展

1．3．1 化合物诱导对丝状真菌细胞凋亡的研究进展

1．3．2 环境胁迫对丝状真菌细胞凋亡的研究进展

1．4 高温胁迫对食用菌影响的研究进展

1．5 转录因子概述

1．6 转录因子的研究方法

1．6．1 凝胶迁移实验

1．6．2 DNase I足迹法

1．6．3 染色质免疫沉淀

1．6．4 电化学阻抗谱

1．7 球孢白僵菌转录因子研究进展

1．7．1 转录因子MSN2研究进展

1．7．2 转录辅因子MBF1研究进展

1．7．3 通用转录因子TBP研究进展

1．8 本研究的内容、目的和意义

第二章 两种侧耳高温胁迫导致的细胞凋亡研究

2．1 试验材料

2．1．1 试验菌株及培养基

2．1．2 试验试剂

2．2 试验仪器

2．3 试验方法

2．3．1 菌丝培养

2．3．2 高温胁迫处理

2．3．3 细胞核浓缩检测

2．3．4 活性氧积累检测

2．3．5 DNA片段化检测

2．3．6 外源添加剂对真菌细胞凋亡的影响

2．3．7 统计分析

2．4 结果与分析

2．4．1 高温胁迫下细胞核的变化

2．4．2 高温胁迫下活性氧的变化

2．4．3 高温胁迫下DNA片段化的变化

2．5 讨论

第三章 球孢白僵菌转录因子BbMSN2与靶基因启动子相互作用的研究

3．1 试验材料

3．1．1 试验菌株及培养基

3．1．2 试验载体

3．1．3 试验试剂

3．2 试验仪器

3．3 试验方法

3．3．1 真菌培养

3．3．2 BbMSN2表达载体的构建

3．3．3 BbMSN2蛋白的外源表达和纯化

3．3．4 靶基因启动子的扩增和特异探针的合成

3．3．5 凝胶迁移实验

3．3．6 数据分析

3．4 结果与分析

3．4．1 pET28GST-BbMSN2表达载体的构建

3．4．2 BbMSN2蛋白的生物信息学分析

3．4．3 BbMSN2蛋白的外源表达和纯化

3．4．3 BbMSN2蛋白结合位点的分析

3．4．4 靶基因启动子序列分析

3．4．5 BbMSN2蛋白与核酸的相互作用

3．5 讨论

第四章 球孢白僵菌BbTBP与TATA-box及BbMBF1相互作用的研究

4．1 试验材料

4．1．1 试验菌株及培养基

4．1．2 试验载体

4．1．3 试验试剂

4．2 试验仪器

4．3 试验方法

4．3．1 真菌培养

4．3．2 BbTBP和BbMBF1表达载体的构建

4．3．3 BbTBP和BbMBF1蛋白的外源表达和纯化

4．3．4 TATA-box序列的分析和合成

4．3．5 凝胶迁移实验

4．3．6 电化学阻抗谱分析

4．4 结果与分析

4．4．1 pET 28a-BbTBP和pET 28a-BbMBF1表达载体的构建

4．4．2 BbTBP和BbMBF1蛋白的生物信息学分析

4．4．3 BbTBP和BbMBF1蛋白的表达及纯化

4．4．4 BbTBP结合位点的序列分析

4．4．5 BbTBP与TATA box探针的相互作用

4．4．6 BbTBP与BbMBF1蛋白间的相互作用

4．5 讨论

第五章 结论

参考文献

致谢

作者简历